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灵芝原生质体的分离及其转化被引量：8: 2001年; 对灵芝 (赤芝 )进行了原生质体的形成和再生实验 ,研究了渗透压稳定剂、菌龄、酶解条件对原生质体分离的影响 ,以及渗透压稳定剂、培养基对原生质体再生的影响 ;另外还尝试用电穿孔法在灵芝原生质体中进行报告基因 (reportgene) β- gal的转化 ,结果 β - gal在菌丝体中有表达。; 张新涛韩春吴立宇薛友纺尚克刚; 关键词：灵芝原生质体

高效建立129/ter、C57BL/6J小鼠胚胎干细胞系的方法学探讨被引量：21: 2002年; A new method for establishing ES cell lines from 129/ter、C57BL/6J mice was set up which was characterized by the murine embryonic fibroblast cell(MEF) feeder, the medium of rat heart cell-conditioned medium(RH-CM)for ES cells, and the consecutive digestion by the digestion liquid containing 1% serum. Every group of improved experiments was done with a control of routine method. The results showed that, compared with routine method, the improved way increased the ratio of ES cell lines of 129/ter mice from 11.8% to 33.3%, and of C57BL/6J from 3.7% to 13.3%. The difference is distinct. The passage culture of ES cells showed that, compared with medium added LIF, RH-CM not only inhibited the differentiation of murine ES cells, maintained its dipoild karyotype, but also promote its adherence growth. This kind of culture condition not only maintained the ES cells in an undifferentiated state and their normal dipoild karyotype, but also a series of other characteristics of totipotent embryonic stem cells during extended culture period.; 孟国良汤富酬尚克刚薛友纺; 关键词：C57BL/6J小鼠胚胎干细胞系建系

PCR对ES细胞定点整合重组子的鉴定被引量：1: 1994年; ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）是一种对ＥＳ（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍ）细胞定点整合重组子进行鉴定的有效方法。由于在定点整合重组子和非定点整合重组子中外源导入基因与基因组ＤＮＡ分子整合的方式各不相同。因此，非重组子、定点整合重组子和非定点整合重组子的基因组ＤＮＡ分子结构也将各不相同。当我们设计合适的引物，从ＰＣＲ扩增结果中即可分析、鉴别出定点整合重组子、非定点整合重组子、或非重组子。本文采用ＰＣＲ方法，根据ｐＲＶ４．０质粒转化ＥＳ细胞（雄性小鼠ＣＣＥ株系）后的不同类型转化子细胞基因组ＤＮＡ分子的特点，设计了两对不同的引物，分别对转化细胞经抗Ｇ４１８，６ＴＧ初步筛选的克隆进行了分析，从中快速、简便、特异性极强地得到了定点整合重组子。我们还用ｓｏｕｔｂｅｒｎ杂交验证了这种方法的准确性。; 薛友纺刘晓冬吴鹤龄; 关键词：PCR ES细胞重组子

5个品系小鼠胚胎干细胞系建立的方法学比较(英文)被引量：17: 2003年; 以 70 %的大鼠心脏细胞条件培养基 (RH CM)为培养液 ,以小鼠胚胎成纤维细胞 (PMEF)为饲养层 ,采用添加 1%鸡血清的消化液和“连续离散法”作为小鼠ES细胞建系的改进方法 ,比较了 5个品系小鼠ES细胞系建立的特点。与常规方法相比 ,3个近交系小鼠 12 9 ter、C5 7BL 6J、BALB c的ES细胞建系率分别由 11 8%、3 7%和 2 9%提高到 33 3%、13 3%和 19 4 % ,差异十分显著 ;直接采用改进的方法建立KM和ICR小鼠ES细胞系 ,建系率分别达 12 %和 4 2 1%。讨论了ICM增殖的时间 ,即离散时机对ES集落形成及建系率的影响 ,结果显示 :12 9 ter、C5 7BL 6J、BALB c、KM和ICR小鼠品系ICM适宜的离散时机分别为增殖 4～ 6d、3～ 3 5d、4d、4～ 5d和 4～ 5d ;同时 ,讨论了不同ES细胞建系所需最适宜的消化液浓度 ,其中BALB c小鼠的ES细胞对高浓度的消化液十分敏感 ,0 0 5 %Trypsin 0 0 0 8%EDTA是其比较理想的离散浓度。设计了两种离散方法 ,即“一次离散法”和“连续离散法” ,用来离散增殖的ICM和ICM离散后出现的ES集落 ,结果表明 :后者在建系过程中的作用明显优于前者。RH CM与添加LIF的常规ES细胞培养基相比 ,不但具有显著抑制小鼠ES细胞分化、维持其二倍体核型的作用 ,而且明显促进ES细胞的贴壁生长。; 孟国良汤富酬尚克刚薛友纺; 关键词：小鼠品系 ES细胞系条件培养基

DNA指纹图在小鼠ES细胞嵌合体鉴定中的应用被引量：3: 2000年; 尝试应用多位点DNA指纹技术 ,检测经过胚胎干细胞 (ES细胞 )途径所获得的嵌合体小鼠中ES细胞在各种脏器中的嵌合情况、检测ES细胞在嵌合体小鼠中是否实现种系传递。结果表明 :采用新型的人工合成的寡核苷酸多聚体探针 (JL 0 2探针 )的多位点DNA指纹图谱 ,具有足够的多态性和很好的稳定性。适用于鉴定ES细胞在嵌合体小鼠各种组织器官中的嵌合情况 ,也适用于鉴定ES细胞是否具有种系嵌合能力 ,尤其适用于在嵌合体研究中 ,最适宜的品种组合具有相同的毛色或相同的酶型。; 汤富酬薛友纺李美琴尚克刚; 关键词：小鼠 DNA指纹图胚胎干细胞嵌合体 RFLP分析

大鼠心脏细胞条件培养基对小鼠ES细胞特性的维持被引量：21: 2001年; 以C1 9- 2和MESPU - 1 3为供试细胞 ,用克隆测试、传代培养等方法对 1 7种细胞的条件培养基进行了筛选 ,结果表明 ,大鼠心脏细胞的条件培养基 (RH -CM)具有显著抑制小鼠ES细胞分化、维持其二倍体核型、促进ES细胞贴壁生长的作用。经RH -CM培养 1 0代和 2 0代的小鼠ES细胞在体内外分化能力上仍保留了原ES细胞的多方向分化潜能和特征 ;RH -CM也可作为小鼠ES细胞培养基的添加物 ,用含 70 %RH -CM的ES细胞培养基和小鼠胚胎原代成纤维细胞饲养层 (PMEF)培养ES细胞 ,可长期有效地维持其未分化状态和二倍体核型。RT; 孟国良滕路邹冀中薛友纺尚克刚; 关键词：ES细胞系 LIF 嵌合鼠 RT-PCR 未分化

双链RNA在基因沉默中的作用被引量：9: 2002年; 介绍依赖于同源识别的基因沉默 .依赖于同源识别的基因沉默 ,是指向生物体内导入外源核酸时引起相应序列的内源基因的表达被特异性抑制的一种基因调控现象 .基因沉默分为转录基因沉默和转录后基因沉默 ,二者都通过双链RNA介导 .它们是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制 .这些机制具有巨大的应用前景 .; 汤富酬李成建薛友纺; 关键词：小干涉RNA 甲基化双链RNA 基因沉默

RNA干涉与基因沉默被引量：70: 2001年; ：双链RNA介导的遗传干涉的机制是1998年发现的。它通过双链RNA的介导特异性地降解相应序列的mRNA，从而导致转录后水平的基因沉默。到目前为止在真菌、拟南芥、线虫、锥虫、水螅、涡虫、果蝇、斑马鱼、小鼠等真核生物中都发现存在这一基因沉默机制。目前的研究表明，RNA干涉与植物中的共抑制（cosuppression）、真菌中的基因压制（quelling）很可能具有共同的基本分子机制。这也说明，很可能在进化的很早期阶段，生物就获得了这种机制。RNA干涉对于抵抗病毒入侵、抑制转座子活动等具有重要作用，对于生物体的发育和基因调控可能也有重要作用。; 汤富酬薛友纺; 关键词：RNA干涉双链RNA 基因沉默

COS-7细胞中小发卡RNA介导的RNA干涉被引量：5: 2003年; 利用U6启动子转录小发卡RNA介导的RNA干涉是最近发展起来的在哺乳动物细胞中特异性抑制指定基因表达的新技术 ,已有实验证明它在小鼠畸胎瘤P19等细胞系中具有强烈的抑制基因表达的作用。本文对COS 7细胞系中U6启动子转录GFP基因的小发卡RNA介导的RNA干涉现象进行了研究 ,结果表明 :U6启动子转录的小发卡RNA具有RNA干涉作用 ,即可以在COS 7细胞中特异性地抑制含有对应序列的基因GFP的表达 ,这一结果为今后在COS 7细胞系中利用RNA干涉技术研究目的基因的功能奠定了基础。; 汤富酬杨红波孟国良李成建尚克刚张博薛友纺; 关键词：RNA干涉 COS-7 绿色荧光蛋白

BALB/c小鼠胚胎干细胞系建立的方法学探讨被引量：28: 2002年; 以小鼠胚胎成纤维细胞 (ME)为饲养层 ,以大鼠心脏细胞条件培养基 (RH CM)为ES细胞培养基 ,全面、详尽地对BALB c小鼠ES细胞的建系和培养方法进行了探讨 ,成功地建立了一套建立和培养BALB c小鼠ES细胞系的新方法。这一培养条件不但有效地维持了ES细胞的未分化状态和正常二倍体核型 ,而且维持了其作为多能性胚胎干细胞的一系列特征 ;实验设计了两种离散方法和两种浓度的消化液 ,用来离散增殖的ICM和ICM离散后出现的ES集落。两种离散方法即“一次离散法” ,和“多次离散法” ,两种浓度的消化液即 0 .2 5 %Trypsin 0 .0 4 %EDTA和0 .0 5 %Trypsin 0 .0 0 8%EDTA ;同时对ICM离散时机、RH CM在BALB c小鼠ES细胞建系和培养中作用进行了探讨。结果表明 :在低浓度消化液作用下 ,采用“多次离散法”离散增殖 4天的ICM和ES集落的方法建立BALB c小鼠的ES细胞系是理想的 ;从细胞形态、集落形态、增殖生长能力、核型检测、碱性磷酸酶测定以及体内外分化能力表明 ,所建立的 9个BALB c小鼠ES细胞系符合小鼠胚胎干细胞的一系列特征。; 孟国良滕路薛友纺尚克刚; 关键词：BALB/C小鼠胚胎干细胞内细胞团 ICM

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