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护骨素配基反义RNA对破骨细胞样细胞生成的影响: 2004年; 目的 :研究护骨素配基 (OPGL)反义RNA对成骨细胞OPGL和护骨素 (OPG)mRNA表达及破骨细胞样细胞 (OLC)生成的影响。方法:构建小鼠OPGLcDNA反义表达载体 ,转染小鼠成骨细胞 ,筛选稳定表达细胞 ,通过RT -PCR研究其OPGL和OPGmRNA表达的变化。将转染有OPGL反义基因的成骨细胞与小鼠骨髓细胞共培养 ,观察OPGL反义RNA对OLC生成的影响。结果:转染有反义OPGLcDNA的成骨细胞OPGLmRNA表达水平显著降低 ,OPGmRNA表达不受影响。其诱导的OLC数目显著减少。结论:OPGL反义RNA抑制了OPGL基因的表达 ,使得成骨细胞促进破骨细胞形成、分化的能力减弱。; 王宝利邱明才梁东春郭刚张镜宇; 关键词：反义RNA 成骨细胞小鼠基因表达

小鼠骨保护素配基胞外片段的表达、纯化及生物活性分析(英文)被引量：2: 2004年; 骨保护素配基 (OPGL)是调节破骨细胞分化和成熟的核心细胞因子。由小鼠骨组织提取总RNA ,RT PCR扩增得到小鼠OPGL胞外片段 (sOPGL)cDNA ,以特定策略克隆入表达载体 pET 4 2a(+) ,以便使未来表达产物的融合标签序列能够完全被因子Xa切除。重组载体在大肠杆菌中诱导表达可获得高水平的 4 7kD产物 ,Westernblotting证实它可被OPGL抗体识别。经Glutathione sepharose 4B亲和层析 ,除融合蛋白外 ,还有一约 30kD蛋白与层析柱发生了特异性亲和。该 30kD蛋白可被GST IGF I多克隆抗体识别 ,但不能被OPGL抗体识别 ,提示它的产生乃由于融合蛋白在融合位点附近发生裂解。融合蛋白经Xa因子裂解和进一步纯化 ,得到分子量约 17 5kD的sOPGL。生物活性分析证明 ,重组sOPGL可以促进OLC的生成 ,并呈现剂量依赖关系。; 王宝利邱明才郭刚梁东春张镜宇; 关键词：纯化大肠杆菌

人骨保护素成熟肽表达载体的构建、表达及重组蛋白免疫学鉴定被引量：4: 2003年; 目的 :构建人骨保护素 (OPG)成熟肽cDNA重组表达载体 ,实现其在毕赤酵母中的高效表达。方法 :由人成骨细胞提取总RNA ,经RT -PCR扩增得到人OPG成熟肽cDNA ,克隆入分泌型表达载体 pPIC9K ,转化酵母细胞 ,G418筛选多拷贝整合的重组子进行甲醇诱导表达 ,产物行Westernblotting 鉴定。结果 :成功构建了人OPG成熟肽表达载体 ,该载体能在酵母细胞中获得分泌表达 ,诱导96h的表达量占上清总蛋白的30 %。重组蛋白相对分子质量约55ku ,可被OPG抗体识别。结论 :重组人OPG成熟肽在酵母表达系统获得较高水平表达 ,为进一步研究开发基因工程药物准备了条件。; 王宝利戴芳郭刚邱明才张镜宇; 关键词：人骨保护素成熟肽重组蛋白免疫学鉴定基因表达

小鼠核因子κB受体活化因子配基(RANKL)活性区cDNA在毕赤酵母中分泌型表达被引量：4: 2003年; 由小鼠骨组织提取总RNA ,采用RT PCR扩增得到小鼠核因子κB受体活化因子配基(RANKL)活性区域cDNA .将该cDNA片段克隆入表达载体pPIC9,重组载体转化巴斯德毕赤酵母GS115细胞 ,筛选Mut+表型 ,经甲醇诱导实现目的基因的分泌型表达 .Tricine SDS PAGE显示 ,表达产物约 2 6kD ,经Western印迹鉴定 ,表达产物可被RANKL抗体识别 .采用硫酸铵盐析、CM SephadexC 2 5层析纯化重组蛋白 .经测定 ,发酵液上清重组蛋白表达量约 11mg L .采用破骨细胞样细胞(osteoclastlikecell,OLC)诱导分化实验检测重组蛋白的生物活性 ,证实该重组蛋白可以促进OLC的生成。; 王宝利郭刚梁东春赵学勤张镜宇邱明才; 关键词：小鼠 CDNA 毕赤酵母分泌型表达

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郭刚