孔繁华
- 作品数：23 被引量：58H指数：5
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- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 构建靶向杀伤白血病细胞的新型重组白细胞介素6D24-PE40KDEL融合蛋白被引量：9
- 2003年
- 目的 构建能高度特异地靶向杀伤高表达白细胞介素 6受体 (IL 6R)白血病细胞的新型重组IL6 PE4 0KDEL(绿脓杆菌外毒素 )融合蛋白。方法 通过定点诱变将绿脓杆菌外毒素PE4 0基因羧基端最后 5个氨基酸REDLK替换成内质网蛋白滞留序列 (KDEL) ,采用重叠延伸的基因融合技术将N 末端缺失 2 4个氨基酸的人IL6 (IL6D2 4 )cDNA与PE4 0KDEL基因进行重组融合构建 ,利用HB10 1/pBV2 2 0表达系统实现该新型重组IL6D2 4 PE4 0KDEL外毒素融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达 ,经MonoQ柱层析纯化后 ,以四甲基偶氮唑类似物 (MTS)法检测IL6D2 4 PE4 0KDEL的靶向杀伤活性。结果 构建的新型重组IL6D2 4 PE4 0KDEL融合蛋白在大肠杆菌中的表达水平达到 4 0 %左右 ;经包涵体分离、复性、变性及纯化所得该融合蛋白纯度 >95 % ;纯化的融合蛋白能与IL6抗体及绿脓杆菌外毒素A(PEA)抗体发生特异性结合 ;IL6D2 4 PE4 0KDEL融合蛋白能高度特异地选择性杀伤高表达IL6R的U937细胞 ,IC5 0约为 2 5 0ng/ml,而对不表达IL6R的人T淋巴白血病细胞系则无杀伤作用。结论 成功构建了具有靶向杀伤高表达IL6R白血病细胞的新型重组IL6D2 4 PE4 0KDEL融合蛋白 ,为深入地探索利用IL6 /IL6R系统介导靶向治疗高表达IL6R白血病奠定了坚实的基础。
- 郑黎燕奚永志孔繁华崔建武粱飞刘楠孙玉英郭斯启
- 关键词：白血病靶向治疗内质网细胞毒试验
- 中国汉族人群人类白细胞抗原HLA不同基因座位间的基因重组被引量：7
- 2007年
- 人类白细胞抗原(human leucocyte antigen,HLA)复合体基因座位间的重组、重组热点、连锁不平衡与疾病易感性的关联性研究已成为免疫遗传学与人类后基因组学等研究领域的研究重点与焦点.本文报道了在中国汉族人群中发现的10例HLA复合体中的基因重组家系.采集重组家系的2～3代家庭成员的外周血标本,首先对其HLA-Ⅰ,Ⅱ类区域的5个经典基因位点进行PCR-SSP低、高分辨率基因分型及SBT分析,然后再进行遗传家系分析研究,确定HLA基因重组相关位点,并对重组家系的单体型进行了群体统计学分析.结果发现,在10例HLA重组家系中有8例重组发生在HLA-A/Cw位点之间,其中4例重组发生在A*02-Cw*03单体型中,2例重组发生在A*24-Cw*03单体型中;1例重组发生在HLA-B/DRB1位点之间,还有1例重组发生在HLA-B/Cw位点之间.群体统计学分析发现,A*02-Cw*03单体型呈一定程度的连锁不平衡但不是很强(?/δ(?)=3.0,?(r)=0.30);另有3个单体型虽呈强连锁不平衡却发生了重组事件,即A*33-Cw*03(?/δ(?)=7.22,?(r)=0.51),A*30-Cw*06(?/δ(?)=10.37,?(r)=0.93)和B*13-Cw*03(?/δ(?)=7.69,?(r)=0.38),这说明重组可能是打破旧的连锁不平衡来产生新的连锁不平衡的重要原因.本文绘制了每个重组家系成员的HLA单体型,并建立了中国汉族人群的HLA重组遗传图谱,初步定位重组发生的范围并分析了位点间重组与连锁不平衡的关系,这为更深入地研究HLA重组事件奠定了基础.
- 骆媛袁方孙玉英金荔梁飞刘楠宋新强刘曙光刘金锋王丹薛红孔繁华奚永志
- 关键词：基因重组家系研究
- 中国汉族白血病患者及其相关人群罕见的HLA-DR/DQ连锁不平衡研究
- 2006年
- 目的研究中国汉族白血病患者及其相关人群罕见的HLA-DR/DQ连锁不平衡单倍型。方法对2000-2005年在我院进行异基因造血干细胞移植前HLA配型的白血病患者及与患者有血缘关系的家系供者共1500例的血液标本,采用低分辨序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)方法进行HLA-DR/DQ基因分型,并对两位点间连锁不平衡参数进行统计学分析。1500例中患者650例,平均年龄25岁;家系供者850例,平均年龄42岁。结果在41例的血液标本中发现13种罕见的连锁不平衡单倍型,主要为HLA-DQ8或HLA-DQ9与不同DR位点的连锁。其中DR14/DQ4、DR4/DQ5、DR9/DQ6、DR9/DQ7、DR8/DQ8、DR9/DQ8、DR12/DQ8、DR13/DQ8和DR14/DQ9共9种单倍型尚未见报道。650例白血病患者中有20例存在12种罕见的连锁不平衡单倍型,850例家系供者中有21例存在8种罕见的连锁不平衡单倍型。DR8/DQ8单倍型只见于家系供者,而DR14/DQ4、DR12/DQ6、DR11/DQ8、DR13/DQ8和DR14/DQ9单倍型则只见于白血病患者。41例HLA-DR/DQ基因分型结果显示,连锁不平衡单倍型与DR52(DRB3)宽抗原相关联者占58.5%(24/41),与DR53(DRB4)宽抗原相关联者占36.6%(15/41),而与DR51(DRB4)宽抗原相关联者仅占4.9%(2/41)。所发现单倍型频率最高的为DR12/DQ8(0.0023)和DR9/DQ8(0.0023),其次为DR11/DQ9(0.0020)和DR12/DQ9(0.0017)。13种连锁不平衡单倍型的绝对及相对连锁不平衡参数均为负值,说明它们在中国汉族人群中较为罕见,并处于连锁不稳定状态。结论发现了罕见的DR/DQ连锁不平衡单倍型,对补充中国汉族人群HLA-DR/DQ基因的连锁不平衡类型,提高HLA分型结果的准确性具有一定意义;同时,DR/DQ连锁不平衡单倍型在不同人群中的差异为疾病关联研究提供了思路。
- 梁飞罗卫东刘楠金荔袁方孔繁华孙玉英奚永志
- 关键词：HLA基因分型单倍型
- 白细胞介素6受体的β亚单位基因和蛋白在人白血病细胞中的表达被引量：2
- 2000年
- 刘爽奚永志郭斯启刘楠屠敏金荔陈兴国孔繁华
- 关键词：白血病蛋白
- 大肠癌与HLA相关研究被引量：2
- 1991年
- 大肠癌是消化道常见的恶性肿瘤,发病率仅次于胃癌、食道癌。该病的病因及发病机制仍不清楚。有人认为与遗传因素有关,如家族性肠息肉病,Garner氏综合症。
- 孔繁华傅新庭白炎史井岗金荔陈兴国孙成文
- 关键词：大肠肿瘤HLA
- 人造血干/祖细胞多态性的研究:Ⅲ.骨髓CD34^+造血干/祖细胞功能亚群的分析
- 1996年
- CD 34^+造血干/祖细胞(HSC/HPC)是十分异质性的,由多个不同功能亚群所构成,在分化方向与重建造血等方面差异显著。本文对正常人骨髓CD 34^+ HSC/HPC各亚群进行了较全面的分析。首先以阳性选择策略,采用Isolex^(TM) 50免疫磁球分选术富集骨髓CD 34^+HSC/HPC,其纯度>90%,随之采用免疫荧光抗体双标记二维流式细胞仪对其测定,发现高纯度的CD 34^+HSC/HPC可分为八个不同亚群:1.CD 34^+/CD 71^-(23.4%—56.6%)与CD 34^+/CD 71^+(33.4%—66.6%);2.CD34^+/CD 45^-(80.8%—82.5%)与CD34^+/CD 45^+(8.1%—11.2%);3.CD 34^+/CD 33^-(20.4%—80.6%)与CD 34^+/CD 33^+(14.6%—64.8%);4.CD 34^+/DR^-(6.3%—11.0%)与CD 34^+/DR^+(82.8%—85.5%)。用免疫胶体金——免疫桥酶联组化双染色对上述亚群进一步分析的结果与流式细胞仪的高度一致。
- 奚永志张双喜唐佩弦魏文孔繁华
- 关键词：CD34^+造血干祖细胞功能亚群骨髓
- 肝癌干扰素-γ基因修饰瘤苗的实验研究被引量：2
- 1998年
- 构建携带人干扰素－γ（ＩＦＮ－γ）ｃＤＮＡ的逆转录病毒载体ｐＺＩＰ－ＩＦＮ－γ，上清感染法导入人肝癌细胞系ＨｅｐＧ２，分泌ＩＦＮ－γ活性为每４８ｈ０～２７３Ｕ／１０６。ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ和ＳｌｏｔＢｌｏｔ验证目的基因的整合及表达。ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ证明ＭＨＣＩ类分子的表达水平增加。体外混合淋巴细胞、肿瘤细胞培养，证实该瘤苗能刺激肝癌病人外周血淋巴细胞的增殖。该瘤苗还能增强ＨＬＡＡ２位点相匹配的肝癌病人外周血淋巴细胞的杀伤活性。结果表明，ＩＦＮ－γ基因修饰的肝癌细胞疫苗，能增强其免疫原性。
- 王征旭何振平李春海孔繁华冯东晓王鑫陈兴国金荔
- 关键词：肝肿瘤基因疗法
- 逆转录病毒介导IFN-γ基因对胆管癌细胞株的影响被引量：1
- 1999年
- 目的：研究人IFN－γ基因对胆管癌细胞株免疫原性的影响。方法：构建携带人IFN－γcDNA的逆转录病毒载体pZIP－IFN－γ，导入人胆管癌细胞系QBC939，运用WesternBlot法分析MHCI类分子的表达，体外混合淋巴细胞、肿瘤细胞培养（MLTR）和淋巴细胞杀伤试验研究导入IFN－γ基因的QBC939细胞免疫原性的变化。结果：G418阳性QBC939－IFN－γ细胞分泌IFN－γ活性为每48h0～9．5IU／106，SouthernBlot和SlotBlot证实了目的基因的整合及表达。WesternBlot证明MHCI类分子表达水平是未转基因亲本瘤细胞的1．78倍。MLTR证实该瘤苗能明显刺激胆管癌病人外周血淋巴细胞的增殖，并能增强HLAA2位点相匹配的胆管癌病人外周血淋巴细胞的杀伤活性。结论：IFN－γ基因修饰瘤苗能增强胆管癌细胞系QBC939的免疫原性。
- 王征旭何振平李春海冯东晓王鑫孔繁华
- 关键词：干扰素-Γ肿瘤疫苗胆管肿瘤
- 人重组造血生长因子双体分子的构建表达及结构特性分析
- ＜正＞ 目的:分子设计并构建较单体分子具有半衰期更长、生物活性更高的新型重组人干细胞因子（SCF）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和血小板生成素（Tpo）的双体分子（分别简称S-S、G-G、T-T）,并在原核系统进行高...
- 郭斯启奚永志孙玉英崔建武刘楠梁飞孔繁华
- 文献传递
- 新型重组免疫抑制蛋白B7-2-L-PE40KDEL的分子构建与生物活性及结构特性被引量：5
- 2002年
- 目的 构建重组B7 2 L PE4 0KDEL融合蛋白 ,特异性杀伤CD2 8高表达的T细胞 ,选择性阻断T淋巴细胞活化过程中的B7:CD2 8/CTLA 4共刺激信号系统 ,由此诱导免疫耐受 ,特异性防治移植物抗宿主疾病 (GVHD)和宿主抗移植物疾病 (HVGD)。方法 采用基因融合序列重叠延伸 (SOE)策略 ,构建新型重组pRSETA B7 2 L PE4 0KDEL外毒素融合蛋白的原核表达载体 ,实现融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达 ,利用亲和层析等方法进行蛋白质纯化。对该融合蛋白的结构特征诸如等电点、柔性等进行模拟分析。采用MTT法对其特异性杀伤高表达CD2 8受体的T细胞的活性进行测定。结果 构建并高效表达了B7 2 L PE4 0KDEL融合蛋白 ,所获融合蛋白的纯度大于 95 %。该融合蛋白的结构特征模拟分析的结果显示 ,其柔性及抗原性、亲水性表位均未显著改变。活性测定显示 ,该重组融合蛋白能有效特异性地杀伤高表达CD2 8的人T淋巴瘤细胞系 ,而对未表达CD2 8的人白血病细胞系则无任何杀伤。结论 具有靶向性免疫抑制活性的新型重组B7 2 L PE4 0KDEL外毒素融合蛋白的构建、表达对特异性防治GVHD和HVGD可能产生积极的影响。
- 袁志宏奚永志张惠丽孔繁华关海容郭斯启刘楠梁飞孙玉英崔建武
- 关键词：生物活性淋巴细胞转化移植物抗宿主病免疫耐受
