王蕾
- 作品数：3 被引量：2H指数：1
- 供职机构：浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室更多>>
- 发文基金：浙江省自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 毛竹丙酮酸磷酸双激酶调节蛋白基因克隆、原核表达及纯化
- 2015年
- 丙酮酸磷酸双激酶调节蛋白(pyruvate,orthophosphate dikinase regulatory proteins,RP)是通过调控丙酮酸磷酸双激酶(pyruvate,orthophosphate dikinase,PPDK)参与C4途径光合碳循环途径。毛竹Phyllostachys edulis作为一种重要的经济竹种,分析克隆RP基因对于竹类植物光合作用的研究具有重大理论和应用价值。通过逆转录实时聚合酶链式反应(RT-PCR)成功克隆得到毛竹Pe RP1,该基因c DNA全长1 275 bp,编码425个氨基酸;经生物信息学预测,该蛋白属于kinase-PPPase超家族,主要含有UDF 299保守结构域;经多序列比对发现毛竹Pe RP1蛋白与C3植物中RP1亲缘关系较近,而与C4植物亲缘关系较远。为了研究Pe RP1的蛋白质结构,我们将Pe RP1蛋白进行原核表达,利用Ni-NTA树脂亲和层析结合分子筛(SEC)层析的方法纯化得到了Pe RP1重组蛋白。SEC纯化的结果表明:Pe RP1蛋白在溶液中主要以多聚体形式存在,二聚体及单体含量较少,推测Pe RP1蛋白可能以多聚体形式参与调控PPDK蛋白。这为今后研究该蛋白的结构与功能打下了良好基础。
- 王超莉张智俊屈亚平王蕾
- 关键词：毛竹基因克隆原核表达蛋白纯化
- 毛竹阿拉伯糖-5-磷酸异构酶的基因克隆、原核表达及纯化被引量：1
- 2016年
- 毛竹Phyllostachys edulis阿拉伯糖-5-磷酸异构酶(Pe Kds D)是2-酮-3-脱氧辛糖酸(KDO)生物合成途径的第1个关键酶。采用逆转录实时聚合酶链式反应(q RT-PCR)克隆得到毛竹Kds D基因。该基因c DNA全长1 038 bp,编码346个氨基酸;对不同物种来源的Kds D氨基酸序列进行比对和系统进化树分析。结果表明:毛竹的Kds D与玉米Zea mays等植物来源的Kds D有很高的序列一致性,而与微生物来源的Kds D序列一致性较低。毛竹不同组织实时荧光定量聚合酶链式反应(q RT-PCR)结果表明:Pe Kds D基因在叶中表达量远远高于其他组织。在大肠埃希菌Escherichia coli原核表达系统中获得了Kds D的可溶性高表达蛋白,将大量表达的重组蛋白经过Ni-NTA亲和层析和分子筛层析(SEC)进行纯化,发现Kds D在溶液(30 mmol·L^(-1)三羟甲基氨基甲烷pH 8.0,200 mmol·L^(-1)氯化钠)中以多种聚体的形式存在;酶学性质测定的结果表明:毛竹Kds D酶最适pH值为pH 8.5,最适作用温度为37℃。此结果为后期研究植物Kds D蛋白的结构与功能奠定了基础。
- 屈亚平张智俊王超莉王蕾吴林军
- 关键词：林木育种学毛竹基因克隆原核表达蛋白纯化
- 拟南芥阿拉伯糖-5-磷酸异构酶的原核表达、纯化及酶催化特性被引量：2
- 2016年
- 阿拉伯糖-5-磷酸异构酶(Kds D)是2-酮-3-脱氧辛糖酸(KDO)生物合成途径的第一个关键限速酶,通过无缝克隆技术将拟南芥Kds D基因构建至原核表达载体p ET-HTT,经过IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了大量重组蛋白的可溶性表达;表达产物经Ni-NTA亲和层析和分子筛层析(SEC)方法进行酶蛋白的分离纯化步骤,得到纯度85%以上的高纯度酶;分子筛层析结果发现纯化后的目的蛋白Kds D在溶液中主要以多聚体、二聚体和单体形式存在,这同微生物来源Kds D酶在溶液中以四聚体形式存在很大差异;进一步使用Western blotting和MALDI-TOF MASS技术对纯化的蛋白进行鉴定;测定了拟南芥Kds D酶学性质,证明该酶催化反应的最适p H值为8.0,最适作用温度为37℃,各种金属离子在低浓度均对酶活性存在不同程度的抑制作用,其中以Co^(2+)、Cd^(2+)对酶活性的抑制作用最强,而5 mmol/L金属螯合剂EDTA对酶有激活作用。此外,以阿拉伯糖-5-磷酸(A5P)为底物时,拟南芥Kds D酶动力学常数Vmax和Km值分别为0.18 mmol/(L·min)、0.16 mmol/L,比较发现该酶与底物的亲和性高于大肠杆菌Kds D。以上研究结果为Kds D蛋白结构与功能及其在新型抗生素研制领域中的工业化应用奠定了基础。
- 屈亚平张智俊王超莉王蕾吴林军
- 关键词：拟南芥MALDI-TOFMASS酶学性质
