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H7N9随机突变病毒库构建及SAα-2,6受体结合特异性的H7N9筛选: 目的：通过对H7N9流感病毒的HA蛋白受体结合域(120-259位氨基酸)随机突变，利用双向反向遗传学系统PCDNA-RG，以A/PR/8/1934(H1N1)病毒内部六基因为骨架，构建H7N9禽流感病毒的随机突变病毒库...; 董方圆; 关键词：反向遗传学基因突变位点血凝素

稳定表达H1N1流感病毒核糖核蛋白的Hela细胞株的建立被引量：1: 2016年; 目的构建稳定表达H1N1流感病毒核糖核蛋白的Hela细胞株,为抗病毒药物筛选提供细胞模型。方法利用基因重组技术构建四种重组真核表达载体pc DNA3.1/Zeo-PB1、pc DNA3.1/Hygro-PB2、pc DNA3.1/Neo-PA、p EF6/V5-His A-NP,进行PCR和DNA测序鉴定;使用Hela细胞依次进行四种抗生素Zeocin、Hygromycin B、Geneticin(G418)、Blasticidin S HCl最小致死浓度实验,获得其最佳筛选浓度;利用Lipofectamine 2000将四种重组真核表达载体依次转染Hela细胞,并添加相应抗生素筛选稳定表达核糖核蛋白细胞株;RT-PCR以及POL I系统鉴定Hela细胞株是否稳定表达H1N1流感病毒核糖核蛋白。结果 RT-PCR初步鉴定流感病毒核糖核蛋白基因片段稳定整合在宿主基因组中,POL I系统证实核糖核蛋白在Hela细胞中已经获得了功能性表达。结论成功构建了Hela-核糖核蛋白细胞株,为以流感病毒RNA聚合酶复合体为靶点的抗流感病毒药物的研究提供了细胞模型。; 丁小满王昕俞若曦彭博武伟华刘慧耿一介董方圆俞慕华房师松; 关键词：HELA细胞甲型流感病毒核糖核蛋白细胞模型

流感病毒两种反向遗传学操作系统的初步构建被引量：2: 2015年; 目的构建依赖辅助病毒和宿主细胞内合成病毒核糖核蛋白复合体(vRNPs)的反向遗传学系统,利用上述两系统表达绿色荧光蛋白(EGFP)。方法将EGFP cDNA精确插入人RNA聚合酶I启动子和小鼠终止子序列之间,构建RNA POLI系统,此系统被克隆入pBluescript II sk(+),获得重组质粒pBluescript II sk(+)-tI-EGFP-PIh;基于辅助病毒H1N1,pBluescript II sk(+)-tI-EGFP-PIh转染MDCK细胞,观察荧光。来源于甲型流感病毒H1N1分离株A/Puerto Rico/8/34的PB2、PB1、PA、NP 4个基因片段cDNA克隆入载体pcDNA3.1(+),获得pcDNA3.1-PB2、pcDNA3.1-PB1、pcDNA3.1-PA、pcDNA3.1-NP,将pBluescript II sk(+)-tI-EGFP-PIh与4个表达质粒共转染293T细胞,观察荧光。结果所构建的载体均经菌液PCR及测序验证正确;两种转染体系均可观察到绿色荧光。结论所构建的依赖辅助病毒和宿主细胞内合成vRNPs的反向遗传学系统均可使绿色荧光蛋白表达。; 连孟洋王昕彭博武伟华刘慧董方圆丁小满房师松郑青; 关键词：反向遗传学绿色荧光蛋白转染

甲型流感病毒跨物种传播的分子机制研究进展被引量：1: 2015年; 甲型流感病毒容易引起人畜共患疾病,严重危害公共卫生事业与畜牧业的发展。通常情况下流感病毒具有宿主限制性,然而历史上发生由流感病毒的跨物种传播屡见不鲜,一旦流感病毒打破宿主限制在人类中传播,对人产生的危害不可估量。本文主要对影响流感病毒跨物种传播的因素进行总结。; 董方圆郑青房师松; 关键词：甲型流感病毒环境因素

H7N9流感病毒感染A549细胞蛋白质组学的初步研究被引量：1: 2016年; 通过建立H7N9和H1N1流感病毒(H1N1pdm09)感染人肺癌上皮细胞(A549)模型,研究病毒感染细胞后细胞蛋白质组学差异变化,探讨H7N9流感病毒感染人类致病机制。将感染复数(MOI)为0.001的H7N9、H1N1pdm09流感病毒感染A549细胞24h、48h、72h后提取细胞总蛋白进行荧光双向差异凝胶电泳(2D-DIGE)和基质辅助激光解析串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS/MS)分析鉴定差异蛋白。质谱共鉴定出H7N9和H1N1pdm09流感病毒感染A549细胞24h、48h、72h上调或下调的差异蛋白分别为11、12、33个。对差异蛋白进行功能分析发现与H1N1pdm09感染组相比,(纤)丝状肌动蛋白成帽蛋白α1(F-actin-capping protein subunit alpha-1,CapZ-α1)、鸟氨酸氨基转移酶(Ornithine aminotransferase,OAT)、Poly(rC)-binding protein 1(PCBP1)、真核翻译起始因子5A-1(Eukaryotic translation initiation factor 5A-1,eIF5A)在H7N9感染A549细胞后表达量的下调加速了致细胞病变效应。血小板活化因子乙酰水解酶Ⅰb亚基β(Platelet-activating factor acetylhydrolaseIb subunit beta,PAFAH1B2)在H7N9感染A549细胞后期表达量显著降低可能与该病毒感染患者的临床症状相关。; 丁小满俞若曦王昕武伟华彭博刘慧耿一介董方圆陆家海俞慕华房师松; 关键词：A549细胞蛋白质组学

α-2,6唾液酸受体结合特异性的H7N9流感病毒的筛选被引量：2: 2016年; 目的筛选与α-2,6唾液酸受体结合特异性的H7N9流感病毒.方法运用随机突变技术处理A/Shenzhen/1/2013（H7 N9）流感病毒HA蛋白头部受体结合域;用反向遗传学技术将其NA基因和突变的HA基因与A/PR/8/34（H1 N1）流感病毒的6个内部基因进行基因重组,构建H7N9流感病毒突变病毒库.并用α2-3唾液酸酶处理的红细胞筛选与α-2-6唾液酸受体结合特性的H7 N9流感病毒.结果筛选出3种类型与α-2,6唾液酸受体结合特异性的H7N9流感病毒突变株.突变位点分别为I126V、S194P/A435S、D127V/S136G/A169T.结论从构建的H7N9流感病毒突变病毒库中成功筛选出与α-2,6唾液酸受体结合特异性的H7 N9流感病毒.; 董方圆王昕丁小满彭博武伟华刘慧耿艺介郑青房师松; 关键词：反向遗传学

深圳H7N9流感病毒PB1-F2基因分子特征被引量：1: 2015年; 目的了解深圳20株H7N9流感病毒PB1-F2基因的分子特征。方法使用DNAstar、MEGA等生物软件对深圳地区H7N9流感病毒PB1-F2进行核苷酸、氨基酸序列同源性和系统进化分析。结果2014年底到2015年H7N9流感病毒爆发主要集中在广东省，以深圳居首。深圳20株H7N9流感病毒PB1-F2基因主要分为三个亚系。3株的PB1-F2基因的N端缺失编码52个氨基酸；1株PB1-F2基因的c端缺失编码57个氨基酸；1株PB1-F2基因的c端缺编码76个氨基酸；其余株PB1-F2基因编码90个氮基酸。各深圳株与A／Anhui／1-DEWH730／2013株相比核苷酸和氨基酸的同源性分别为96．0％-100％和89．O％～100％。各深圳株之间的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为94．9％～100％和85．7％～100％。结论深圳H7N9流感病毒PB1-F2基因具有独特的分子特征。; 董方圆王昕彭博武伟华刘慧丁小满郑青房师松; 关键词：进化分析

α-2,6唾液酸受体结合特异性的H7N9流感病毒的初步筛选: 目的筛选与α-2,6唾液酸受体结合特异性的H7N9流感病毒。方法本研究运用随机突变技术处理henzhen/1/2013(H7N9)流感病毒HA蛋白头部受体结合域;用反向遗传学技术将其NA基因和突变的HA基因与A/PR/8...; 董方圆王昕丁小满彭博武伟华刘慧耿艺介郑青房师松; 关键词：反向遗传学; 文献传递

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董方圆