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美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备被引量：2: 2017年; 目的原核表达美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(North American genotype porcine reproductive and respiratory syndrome virus,NA-PRRSV)N蛋白,并制备多克隆抗体。方法以NA-PRRSV QH-08毒株的RNA为模板,扩增N蛋白编码片段,克隆入原核表达载体p ET30a(+),构建重组表达质粒pET30a-NA-PRRSV-N,转入大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达6 h。采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化表达的重组蛋白,复性后的重组N蛋白与弗氏佐剂混合乳化,经背部多点免疫新西兰大耳白兔,制备兔抗NA-PRRSV-N蛋白多克隆抗体,采用Western blot和间接免疫荧光试验检测多克隆抗体的特异性,间接ELISA法检测血清抗体效价。结果经PCR、双酶切和测序鉴定,重组表达质粒p ET30a-NA-PRRSV-N构建正确;重组N蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约为24 000,纯度可达95%以上,可与NA-PRRSV阳性猪血清发生特异性反应;制备的多克隆抗体能够识别重组N蛋白和全病毒抗原,抗体效价>1∶25 600,显著高于商品化疫苗组。结论成功在大肠埃希菌中表达了NA-PRRSV N蛋白,并制备了其多克隆抗体,为NA-PRRSV检测方法的建立奠定了基础。; 欧云文王勤马炳马小元代军飞贾宁丁耀忠张永光张杰; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 N蛋白原核细胞基因表达多克隆抗体

猪细小病毒分子生物学诊断技术研究进展: 猪细小病毒是引起母猪繁殖障碍的重要病原之一,给养猪业带来巨大经济损失。本文从PCR、核酸探针和环介导等温扩增技术等方面,对猪细小病毒的分子生物学诊断技术进行综述,为猪细小病毒病的诊断及防制提供参考。; 欧云文马小元刘亚丽张杰; 关键词：猪细小病毒分子生物学; 文献传递

一种带链牛鼻钳: 本实用新型公开了一种带链牛鼻钳，包括对称设置的左、右钳体，所述左、右钳体分别包括圆弧部与直线部，所述圆弧部端部设置为圆球状钳嘴，所述左、右钳体的直线部交叉，并通过磁铁齿形锁紧装置连接，在所述左、右钳体另一端还设置有固定铁...; 马小元张杰刘永生丁耀忠胡文张永光; 文献传递

猪细小病毒1型VP2基因的原核表达及反应原性分析被引量：1: 2017年; 旨在研究猪细小病毒1型(PPV1)VP2蛋白(第155-439位氨基酸)的抗原性,为开发PPV1的检测方法奠定基础。以PPV1型AV31株的DNA为模板,扩增获得849 bp的目的片段,扩增产物克隆入p ET30a(+)原核表达载体,构建p ET30aPPV1-VP2(155-439 aa)重组质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3);在37℃,以1 mmol/L IPTG诱导表达6 h;采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白,并用不同浓度的尿素对纯化蛋白进行复性。SDS-PAGE分析表明,该VP2编码基因在大肠杆菌中得到表达,蛋白大小约为39 k D;Western blot检测结果表明,该重组蛋白与PPV1阳性血清发生特异性反应,与NA-PRRSV和PCV2阳性血清不发生交叉反应。该实验成功构建了PPV1-VP2(155-439 aa)原核表达载体,实现了在大肠杆菌中的表达,纯化后的复性蛋白具有较好的反应原性。; 欧云文马小元张杰丁耀忠张永光贾宁; 关键词：VP2基因原核表达反应原性

PRRSV细胞受体CD163 SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法的建立被引量：2: 2017年; 为了探索猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)细胞受体CD163在宿主感染PRRSV过程中的表达情况,根据CD163的序列在其保守区设计了1对特异性引物,基于SYBR GreenⅠ荧光染料建立了一步法检测CD163的实时荧光定量RT-PCR(real time RT-PCR)法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验及样品检测试验。结果表明:建立的方法具有较高的特异性,PRRSV的其他几个受体(CD151、HS)均为阴性反应;对CD163的检测下线为10个拷贝数的模板RNA,比常规RT-PCR方法的灵敏度高10倍;对样品进行3次组内和组间重复试验,变异系数(CV)<2%,具有较好的重复性和稳定性;利用该方法对PRRSV感染Marc-145细胞后不同时间段CD163的转录水平进行检测,结果显示CD163在48小时时的mRNA含量明显高于其他各时间段。说明所建立的针对CD163的检测方法完全可以应用于临床样品的检测。; 马小元丁耀忠王俊张杰张永光; 关键词：SYBR 荧光定量RT-PCR MARC-145细胞

猪繁殖与呼吸综合征病毒及其病毒样颗粒疫苗的研究进展被引量：4: 2017年; 自北美地区出现猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)以来,此病已有几十年的历史,给养猪业带来了毁灭性的打击。感染此病后呼吸系统症状增加,主要侵袭肺部,病变明显而且继发其他病毒和细菌性疾病;怀孕母猪会产生繁殖障碍,导致流产,产死胎和木乃伊胎等。迄今为止临床上仍然使用灭活疫苗和弱毒疫苗来预防此病,但是这两种疫苗都有不可调和的缺陷,并不能提供完全保护力。新型基因工程疫苗病毒样颗粒(VLPs)疫苗是目前的研究热点,因其不具有感染性病毒的遗传物质,仅含有病毒的几种主要结构蛋白,不会造成感染,安全系数高,免疫效果好而被普遍接受。但是猪繁殖与呼吸综合征病毒的VLPs疫苗仍处于实验室开发阶段,不过已经给各类疾病疫苗的研发提供了一个新的思路。文章对猪繁殖与呼吸综合征及其病毒样颗粒疫苗进行综述。; 王俊马小元欧云文张永光张杰; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征免疫应答常规疫苗

南非2型口蹄疫病毒VP1基因的核苷酸及其氨基酸序列分析被引量：3: 2016年; VP1基因的遗传衍化关系是口蹄疫病毒分型的依据,而且许多重要的抗原位点也都位于VP1蛋白上。为了对南非2型口蹄疫病毒(SAT2-FMDV)VP1的编码基因序列及其氨基酸序列进行分析,为南非2型口蹄疫的诊断及疫苗设计提供理论基础,试验从NCBI下载大量的南非1/2/3型口蹄疫病毒(SAT1/2/3-FMDV)的1D2A2B基因片段,通过序列分析选择相似性较低的序列代表SAT1/2/3,将选中的代表序列连接于p UC57载体上进行合成,再对合成的含目的序列的穿刺菌进行划板、挑单克隆、摇菌、提质粒,得到重组质粒初步进行酶切鉴定后进行测序,测序正确后采用DNAStar软件包对这些合成序列进行分析。结果表明:SAT2-FMDV VP1的编码基因核苷酸序列变异度较大;虽然SAT2口蹄疫病毒VP1蛋白上主要抗原位点位置与其他血清型的差异性并不大,但是关键氨基酸已发生变化。; 刘亚丽丁耀忠马小元张杰张永光; 关键词：口蹄疫病毒 VP1基因核苷酸序列氨基酸序列

猪繁殖与呼吸综合症病毒的生物学结构: <正>猪繁殖与呼吸综合征病毒于20世纪早期在欧洲最先发现,现在已在全球范围内传播。PRRSV主要引起患猪持续性呼吸障碍、体重减轻、生长迟缓,以及妊娠母猪的流产。病毒基因组的变异、持续的继发感染和PRRS的流行性给防治本病...; 马小元丁耀忠王俊张杰张永光; 关键词：猪繁殖与呼吸综合症病毒非结构蛋白囊膜蛋白核衣壳蛋白; 文献传递

光定量PCR技术在常见猪繁殖障碍性疫病中的应用: <正>目前,猪繁殖障碍性疫病给全球的养猪业造成严重的经济损失,严重制约养猪业的怏速健康的发展。引起猪繁殖障碍性疫病的病毒主要是猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）、日本乙型脑炎病毒（JEV）、猪伪狂...; 欧云文马小元王俊张永光张杰; 关键词：生物学特性聚合酶链式反应荧光检测; 文献传递

猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达及反应原性分析被引量：5: 2017年; 研究猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的抗原性,为开发PCV2的检测方法奠定基础。以PCV2CAU0673毒株的DNA为模板,扩增获得702bp的目的片段,扩增产物克隆入pET30a(+)原核表达载体,构建pET30a-PCV2-ORF2重组质粒,转入大肠埃希菌BL21(DE3);在37℃以1mmol/L IPTG诱导表达6h;采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白,并用不同浓度的尿素对纯化蛋白进行复性。SDSPAGE分析表明,该ORF2编码基因在大肠埃希菌中得到表达,蛋白大小约为34ku;Western blot检测结果表明,该重组Cap蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,与NA-PRRSV和PPV1血清不发生交叉反应。成功构建了PCV2-ORF2原核表达载体,实现了在大肠埃希菌中的表达,纯化后的复性蛋白具有较好的反应原性,为猪圆环病毒2型检测方法建立或试剂盒的开发奠定了基础。; 欧云文马小元王俊丁耀忠张永光张杰; 关键词：猪圆环病毒2型 ORF2基因原核表达反应原性

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马小元

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