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PRRSV细胞受体CD163 SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法的建立被引量：2: 2017年; 为了探索猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)细胞受体CD163在宿主感染PRRSV过程中的表达情况,根据CD163的序列在其保守区设计了1对特异性引物,基于SYBR GreenⅠ荧光染料建立了一步法检测CD163的实时荧光定量RT-PCR(real time RT-PCR)法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验及样品检测试验。结果表明:建立的方法具有较高的特异性,PRRSV的其他几个受体(CD151、HS)均为阴性反应;对CD163的检测下线为10个拷贝数的模板RNA,比常规RT-PCR方法的灵敏度高10倍;对样品进行3次组内和组间重复试验,变异系数(CV)<2%,具有较好的重复性和稳定性;利用该方法对PRRSV感染Marc-145细胞后不同时间段CD163的转录水平进行检测,结果显示CD163在48小时时的mRNA含量明显高于其他各时间段。说明所建立的针对CD163的检测方法完全可以应用于临床样品的检测。; 马小元丁耀忠王俊张杰张永光; 关键词：SYBR 荧光定量RT-PCR MARC-145细胞

PRRSV标记病毒样颗粒的制备及其鉴定被引量：1: 2018年; 当今预防猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）的灭活苗和弱毒苗都存在不可避免的局限性,所以研制新型疫苗势在必行。病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）在形态结构上与天然病毒粒子无异,生物安全指数高,是理想的传统疫苗替代品。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）粒子主要由能够诱导产生中和抗体的GP5蛋白和具有强细胞免疫力的M蛋白组成基本框架结构。本研究以2型高致病性PRRSV的GP5蛋白和M蛋白为研究对象,通过Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统,构建标记型PRRSV VLPs,同时探索核衣壳蛋白N对VLPs形成的影响。在本试验中将含有Myc标签的GP5（Myc-GP5）和含有His标签的M（His-M）蛋白基因分别克隆至pFastBac dual载体的p10和pH双元启动子下;N蛋白基因克隆至pFastBac HTB载体上,转染sf9和Highfive细胞后,GP5、M和N蛋白均被成功表达。透射电镜观察结果表明,Myc-GP5和His-M能够自动组装成VLPs,并且与天然PRRSV形态一致,具有双层膜结构,直径大小在40-60 nm。采用抗M蛋白的家兔血清进行免疫电镜观察,结果显示,Myc和His双标记型VLPs与天然病毒一样都能够被金颗粒标记,而且共感染的N蛋白不影响标记型VLPs的组装。本研究首次采用昆虫杆状病毒表达系统成功制备了PRRSV的双标记型VLPs,具备与天然病毒相似的特性,为开发高效安全以及能够区分感染与免疫VLPs疫苗奠定了基础。; 王俊代军飞马炳丁耀忠李茜侯谦乌云达来李克斌杨儒爱刘永生张永光张杰; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征结构蛋白共感染

猪繁殖与呼吸综合征病毒及其病毒样颗粒疫苗的研究进展被引量：4: 2017年; 自北美地区出现猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)以来,此病已有几十年的历史,给养猪业带来了毁灭性的打击。感染此病后呼吸系统症状增加,主要侵袭肺部,病变明显而且继发其他病毒和细菌性疾病;怀孕母猪会产生繁殖障碍,导致流产,产死胎和木乃伊胎等。迄今为止临床上仍然使用灭活疫苗和弱毒疫苗来预防此病,但是这两种疫苗都有不可调和的缺陷,并不能提供完全保护力。新型基因工程疫苗病毒样颗粒(VLPs)疫苗是目前的研究热点,因其不具有感染性病毒的遗传物质,仅含有病毒的几种主要结构蛋白,不会造成感染,安全系数高,免疫效果好而被普遍接受。但是猪繁殖与呼吸综合征病毒的VLPs疫苗仍处于实验室开发阶段,不过已经给各类疾病疫苗的研发提供了一个新的思路。文章对猪繁殖与呼吸综合征及其病毒样颗粒疫苗进行综述。; 王俊马小元欧云文张永光张杰; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征免疫应答常规疫苗

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白的原核可溶性表达和间接ELISA抗体检测方法的初步建立被引量：8: 2018年; 猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的核衣壳蛋白N是一种含量高、免疫原性强、最早刺激机体产生特异性抗体的主要结构蛋白，研制针对N蛋白抗体的检测方法对进一步实现PRRS的流行病学监测和诊断具有重要意义。本研究以带有MBP标签的pMAL—C4X作为表达载体。实现了N蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达，每升菌液经纯化可得约20mg的融合N蛋白。Western—blot结果表明．融合N蛋白能被抗MBP的单抗和PRRSVN蛋白的家兔多抗特异识别。以融合N蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法不与猪圆环病毒2型（PCV2）、古典猪瘟病毒（CSFV）、伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）的阳性猪血清发生交叉反应，但与1型PRRSV阳性猪血清有较强反应性。田间样品检测结果表明。本研究建立的间接ELISA抗体检测方法与IDEXX同类试剂盒的总符合率为90％左右。本研究以MBP作为促溶标签，实现了PRRSVN蛋白在大肠杆菌内的高效可溶性表达，重组蛋白具有良好的免疫反应性．这为深入研究N蛋白功能以及开发PRRS相关诊断制剂奠定了基础。; 王俊代军飞马炳马炳丁耀忠刘永生刘永生张永光张永光; 关键词：核衣壳蛋白原核可溶性表达间接ELISA 抗体检测

PRRSV N蛋白的原核可溶性表达方法及间接ELISA抗体检测方法: 本发明公开了一种PRRSV N蛋白的原核可溶性表达方法及间接ELISA抗体检测方法，PRRSV N蛋白的原核可溶性表达方法包括(1)根据大肠杆菌密码子偏嗜性特征，人工优化并合成PRRSV N蛋白编码基因；(2)以MBP作...; 张杰张永光丁耀忠刘永生代军飞王俊马炳欧云文孙跃峰吕建亮邵军军周鹏

不同粒径口蹄疫病毒样颗粒-ZIF-8复合物诱导小鼠的体液免疫效果分析被引量：1: 2023年; 为进一步提高口蹄疫(foot-and-mouthdisease,FMD)病毒样颗粒(virus-likeparticles,VLPs)疫苗的免疫效果,本研究采用仿生矿化方法,将Zn2+和2-甲基咪唑按照不同浓度配比制备了不同粒径的FMDV VLPs-沸石咪唑骨架-8(zeolitic imidazolate framework-8,ZIF-8)复合物,以探究尺寸效应对免疫效果的影响。结果显示,成功制备出3种不同粒径的FMDV VLPs-ZIF-8,粒径分别约为70、100、1000 nm。细胞毒性和组织病理学试验表明,3种复合物均具有良好的生物安全性。小鼠免疫试验表明,3种复合物均能明显提高中和抗体和特异性抗体水平,并且随着复合物体积的减小,其免疫效果也随之增强。本研究表明,ZIF-8包封FMDV VLPs可显著增强其免疫效果,且具有尺寸依赖性。; 李家俊王俊张韵张韵董虎董虎郭慧琛; 关键词：佐剂尺寸效应

病毒样颗粒作为口蹄疫病毒抗原表位载体的研究进展被引量：2: 2019年; 病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)不含有病毒核酸,不具有自我复制的能力,但拥有与完整病毒粒子相似的空间结构和免疫原性,可以作为口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)抗原表位的载体,将其展示在它的表面。主要介绍了作为FMDV抗原表位的VLPs载体:FMDV-VLPs、HBc-VLPs、PCV2-VLPs和PPV-VLPs,并阐述了VLPs在几种表达系统中的组装现状,以期为今后有关FMD的VLPs研究提供参考。; 李茜代军飞王俊丁耀忠马炳刘永生张永光张杰; 关键词：病毒样颗粒口蹄疫病毒抗原表位疫苗

猪繁殖与呼吸综合症病毒的生物学结构: <正>猪繁殖与呼吸综合征病毒于20世纪早期在欧洲最先发现,现在已在全球范围内传播。PRRSV主要引起患猪持续性呼吸障碍、体重减轻、生长迟缓,以及妊娠母猪的流产。病毒基因组的变异、持续的继发感染和PRRS的流行性给防治本病...; 马小元丁耀忠王俊张杰张永光; 关键词：猪繁殖与呼吸综合症病毒非结构蛋白囊膜蛋白核衣壳蛋白; 文献传递

猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达及反应原性分析被引量：5: 2017年; 研究猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的抗原性,为开发PCV2的检测方法奠定基础。以PCV2CAU0673毒株的DNA为模板,扩增获得702bp的目的片段,扩增产物克隆入pET30a(+)原核表达载体,构建pET30a-PCV2-ORF2重组质粒,转入大肠埃希菌BL21(DE3);在37℃以1mmol/L IPTG诱导表达6h;采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白,并用不同浓度的尿素对纯化蛋白进行复性。SDSPAGE分析表明,该ORF2编码基因在大肠埃希菌中得到表达,蛋白大小约为34ku;Western blot检测结果表明,该重组Cap蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,与NA-PRRSV和PPV1血清不发生交叉反应。成功构建了PCV2-ORF2原核表达载体,实现了在大肠埃希菌中的表达,纯化后的复性蛋白具有较好的反应原性,为猪圆环病毒2型检测方法建立或试剂盒的开发奠定了基础。; 欧云文马小元王俊丁耀忠张永光张杰; 关键词：猪圆环病毒2型 ORF2基因原核表达反应原性

一种PRRSV的双标记型病毒样颗粒(VLPs)的制备: 本发明公开了一种PRRSV的双标记型病毒样颗粒(VLPs)的制备及鉴定方法，涉及生物研究技术领域，制备含有GP5、M和N蛋白编码基因ORF5、ORF6和ORF7的pMD18T重组质粒，为扩增模板，ORF5末端引入Myc标...; 张杰张永光刘永生代军飞王俊丁耀忠马炳欧云文孙跃峰李茜侯谦; 文献传递

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王俊

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