张利坤
- 作品数：6 被引量：2H指数：1
- 供职机构：浙江工业大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：化学工程生物学环境科学与工程更多>>
- 生物法拆分甲霜灵生产R-甲霜灵的研究
- 甲霜灵是一种广谱性酰胺类手性杀菌剂,对一些作物的病原真菌引起的病害有良好的防治作用。它存在一对对映体异构体,杀菌活性主要来自于R-型。本研究从土壤中成功分离出一株用来拆分甲霜灵的菌株（含相应的酯酶）,从细胞粗酶液中分离纯...
- 张利坤
- 关键词：菌种筛选酯酶
- 一种不对称水解(R,S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯的新酯酶基因的克隆表达和酶学性质研究被引量：1
- 2016年
- 本文将来自反硝化无色杆菌Achromobacterdenitrificans1104的酯酶基因EHest,转化大肠杆菌中,成功表达了具有不对称水解农药甲霜灵的中间体(R,S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯(MAP)活性的酯酶EHesterase。用重组酯酶EHesterase催化MAP的水解,底物浓度50 g/L,反应1h的转化率29.5%,产物(R-酸)的eep是85.1%。该酶的最适反应pH和温度分别为9.0和50℃,在50℃以下和pH5~9之间具有较好的稳定性。该酶水解MAP的米氏动力学参数Vm、Km分别是0.733 g/(L·min)和7.49 g/L。加入10%DMSO对酶EHesterase的立体选择性和催化速度有一定的促进作用。Cu^(2+)、Fe^(3+)对酶活有明显抑制作用。该酶水解MAP的活性与水解p-对硝基苯乙酸酯的活性数量级相当,是水解橄榄油活性的333倍。
- 董剑鸣张利坤卢亚南姚星超杨玉莹陆跃乐张朝晖
- 关键词：酯酶克隆表达酶学性质
- 白色杆菌zjut528及在拆分甲霜灵中的应用
- 本发明公开了一株白色杆菌Albibacter sp.zjut528及其在拆分甲霜灵中的应用；本发明菌株催化外消旋甲霜灵的不对称水解，反应18h，底物转化率达到47.5％，ee<Sub>p</Sub>达到99.9％，主要产...
- 张朝晖张利坤
- 白色杆菌zjut528及在拆分甲霜灵中的应用
- 本发明公开了一株白色杆菌Albibacter sp.zjut528及其在拆分甲霜灵中的应用，所述菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年10月29日，保藏编号CCTCC NO.M 2015650，保藏地址为...
- 张朝晖张利坤
- 不对称水解(R,S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯新菌种的分离鉴定及酯酶基因的克隆、表达被引量：1
- 2016年
- 【目的】筛选鉴定1株可以选择性水解农药甲霜灵的中间体(R,S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯(MAP)的菌株,并克隆、表达该菌株中的酯酶基因。【方法】以MAP为唯一碳源,对活性污泥样品中的微生物进行富集培养,采用罗丹明B平板显色法进行初筛,通过摇瓶复筛得到了1株对MAP具有最高对映体选择性和水解活力的新菌株,根据其形态、生理生化特征及16S rRNA序列分析,确立该菌株的系统发育学地位。构建该菌株的基因文库,筛选获得含目的基因的克隆子,通过序列分析和引物扩增得到酯酶基因,将基因与表达载体pET28a(+)连接后,转化大肠杆菌BL21Gold(DE3)plysS,构建重组菌。【结果】该菌属于革兰氏阴性菌,结合16S rRNA基因、形态特征和生理生化实验结果,鉴定该菌为反硝化无色杆菌。通过基因文库法,找到了该菌中的酯酶基因EHest,并成功构建了重组大肠杆菌EHest-p ET28a(+)-BL21Gold(DE3)plys S,表达了来自Achromobacter denitrificans 1104且具有不对称水解MAP活性的酯酶EHesterase,大小约27 kDa,表达酶活是原始菌株的27.1倍。用EHesterase催化MAP水解,底物浓度50 g/L,反应1 h,底物转化率为29.5%,产物(酸)的ee_p为85.1%,对映体选择性为R型。该酶的最适反应pH和温度分别为pH 9.0和50°C。它水解MAP的活性分别是水解橄榄油和乙酸乙酯活性的333倍和667倍。【结论】筛选到1株具有不对称水解MAP能力的新菌株Achromobacter denitrificans 1104。
- 卢亚南张朝晖张利坤陆跃乐
- 关键词：酯酶基因克隆表达甲霜灵
- 白色杆菌zjut528及在拆分甲霜灵中的应用
- 本发明公开了一株白色杆菌Albibacter sp.zjut528及其在拆分甲霜灵中的应用；本发明菌株催化外消旋甲霜灵的不对称水解，反应18h，底物转化率达到47.5％，ee<Sub>p</Sub>达到99.9％，主要产...
- 张朝晖张利坤
