楼庄伟
- 作品数：20 被引量：10H指数：2
- 供职机构：黑龙江大学生命科学学院更多>>
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- 相关领域：生物学农业科学医药卫生更多>>
- 昆虫细胞中表达eGFP基因的重组杆状病毒的构建
- 2013年
- 为构建表达增强型绿色荧光蛋白(eGFP)融合蛋白的昆虫杆状病毒转移载体。利用Sf-9细胞表达eGFP,用PCR法从重组Bacmid和pEGFP-C3质粒中扩增gp64SP、eGFP和VSVGED片段,利用一步法SOE-PCR将3个片段连接在一起。用XbaI和HindIII酶切融合片段与pFastBacPH,连接获得阳性质粒命名为pFB/LM-PH。转化E.coliDH10Bac,通过转座子Tn7的介导,获得重组杆状病毒Bv-LM-PH,感染Sf9昆虫细胞。结果表明:通过倒置荧光显微镜观察细胞形态及荧光表达情况;结果证实:感染的Sf9细胞可表达外源基因eGFP。重组pFB/LM-PH载体具备表达eGFP的能力,为分子生物学研究提供了一种新型可表达eGFP融合蛋白的昆虫杆状病毒表达载体。
- 唐晓艳高冬妮李梅葛菁萍平文祥楼庄伟
- 关键词：昆虫杆状病毒表达系统增强型绿色荧光蛋白昆虫细胞
- 一种可用于制作禽类疫苗的重组杆状病毒的制备方法
- 一种可用于制作禽类疫苗的重组杆状病毒的制备方法，它涉及一种重组杆状病毒的制备方法。它为制作出可防治禽类传染性疾病的重组杆状病毒疫苗奠定了物质基础。其制备方法：(一)构建含有CMV－IE启动子的载体；(二)构建带有CMV－...
- 楼庄伟平文祥葛菁萍李盛贤宋刚凌宏志高冬妮张贺楠
- 文献传递
- 构建具有巨细胞病毒(CMV)启动子的杆状病毒高效表达载体并利用其在鸡胚原代细胞中表达eGFP基因被引量：1
- 2013年
- 【目的】杆状病毒载体在哺乳动物细胞中不复制,具有极高的生物安全性,而通过引入细胞特异性启动子、"病毒假型化"、添加不同功能调控元件等优化手段,杆状病毒可转导的细胞类型明显增多、转导效率明显增高。优化的重组杆状病毒可以在鸡细胞中表达,确定重组杆状病毒在鸡细胞中高效表达的条件,为禽类基因工程疫苗的开发奠定了坚实的基础。【方法】本研究以增强型绿色荧光蛋白(Enhanced GreenFluorescent Protein,eGFP)为报告基因,构建含巨细胞病毒(Cytomegaoviyns,CMV)启动子启动的重组转座载体,并且通过病毒假型化(TM/CTD of VSV-GED)、添加转录后调控元件(Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element,WPRE)和腺病毒反向重复序列(Inverted terminal repeats,ITRs)等手段优化重组杆状病毒表达载体,最终利用重组杆状病毒对鸡胚原代细胞的侵染进行eGFP的表达,比较分析不同重组载体对蛋白表达水平的影响。【结果】eGFP表达结果显示,12 h便可在倒置荧光显微镜下检测出eGFP的表达,随着时间的延长,eGFP表达效率先增加后降低。经过VSVGED病毒假型化的重组杆状病毒转导效率从36%增加至48.2%。添加转录后调控元件WPRE的重组杆状病毒介导eGFP的表达效果与添加10mmol/L丁酸盐法基本相同,但对细胞几乎没有毒性。从72 h内的eGFP表达强度看,只有添加ITRs元件的重组杆状病毒的表达强度随时间的延长而极缓慢增加。【结论】eGFP表达结果显示,利用VSVGED病毒假型化手段可以提高杆状病毒转导鸡胚原代细胞的效率;添加转录后调控元件WPRE的重组杆状病毒介导eGFP的表达效果与添加丁酸盐法基本相同,可以增强杆状病毒介导报告基因在鸡胚原代细胞中的表达水平;添加ITRs元件的重组杆状病毒具有延长eGFP表达时间的作用。
- 宋姗姗葛菁萍李梅高冬妮金丽颖安琦平文祥楼庄伟
- 关键词：杆状病毒调控元件
- 杆状病毒介导的哺乳动物细胞基因转移及其影响因素被引量：1
- 2009年
- 杆状病毒作为优良的哺乳动物细胞基因转移载体已在基因治疗、疫苗开发、药物筛选以及基因调控研究等方面发挥巨大作用。但杆状病毒对哺乳动物细胞的嗜性不够广泛、转导效率和转基因表达水平偏低,以及表达持续时间短暂等问题制约其进一步发展,因此如何突破这个制约的瓶颈成为学者们新的关注焦点。针对以上问题,围绕杆状病毒介导哺乳动物细胞基因转移的各种影响因素进行综述。
- 李梅王昆葛菁萍高冬妮楼庄伟平文祥
- 关键词：基因转移哺乳动物细胞
- 构建基于杆状病毒的BV-T7杂合表达体系及利用其在哺乳动物和禽类细胞中表达eGFP基因
- 2012年
- 【目的】研究重组杆状病毒BV-T7杂合表达体系能否有效转导禽类细胞并在禽类细胞中表达外源基因(eGFP),从而构建能在禽类细胞中高效稳定表达外源基因的重组杆状病毒表达系统。【方法】本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,结合T7表达系统,通过对eGFP表达水平的调控来把握噬菌体T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)的功能。利用两支重组杆状病毒,pFastBac-CMV-T7 RNAP重组杆状病毒为哺乳动物细胞启动子CMV调控的噬菌体T7 RNA聚合酶的cDNA;pFB-T7pro-IRES-GFP-T7ter重组杆状病毒为T7启动子控制的eGFP报告基因。将两支重组杆状病毒共同侵染哺乳动物OL(oligodendrocyte)细胞、鸡胚成纤维细胞和鸡胚骨骼肌细胞。【结果】两支重组杆状病毒利用T7启动子和T7 RNAP,在OL细胞、鸡胚成纤维细胞和鸡胚骨骼肌细胞中成功表达eGFP报告基因,而且未引起细胞病变,但在鸡胚原代细胞中eGFP的表达相对弱于在OL细胞中的表达。在OL细胞中重组杆状病毒对细胞的转导效率为59.5%,在鸡胚成纤维细胞和鸡胚骨骼肌细胞中转导效率分别为23.2%和33.1%。【结论】本研究构建的基于杆状病毒、T7RNA聚合酶、T7启动子(BV-T7)杂合表达体系能够在哺乳类细胞及禽类细胞中表达T7 RNAP,并利用T7RNAP继续高效而稳定地表达外源基因。这为难于体外操作的RNA病毒提供了有效的研究方法,并对新型基因工程疫苗的研制提供了一个高效而稳定的表达载体系统。
- 葛菁萍唐晓艳高冬妮宋姗姗鲁珊楼庄伟平文祥
- 关键词：重组杆状病毒EGFP
- HA-VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法
- HA-VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，涉及基因重组杆状病毒表达载体的构建方法。它解决了目前杆状病毒介导的外源基因在CHO细胞中的表达率较低的问题。方法：一、以pMD18-T-VP2为模板进行PCR扩增，获得目的...
- 葛菁萍高冬妮宋刚凌宏志平文祥楼庄伟唐晓艳金丽颖安琪田兆峰
- 文献传递
- EF1α启动的高效重组杆状病毒载体的构建及其表达效果被引量：2
- 2014年
- 【目的】通过选用哺乳动物细胞特异性启动子—人类延伸因子1α启动子(Elonggation factor 1αpromoter,EF1-α)、利用病毒假型化工具—截断型水疱型口膜炎病毒G蛋白(Truncated Vessicular stomatitis virus protein G,VSV-GED)、添加转录后调控元件(Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element,WPRE)和腺病毒反向重复序列(Inverted terminal repeats,ITRs),来提高杆状病毒的转导效率及外源基因的表达水平。【方法】从pFB-VSV-GED-WPRE出发构建含EF1α启动子的2个重组杆状病毒转移载体pWK和pWK-ITR。再以增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,eGFP)基因为报告基因插入EF1α启动子的下游,构建重组转移载体pWK-eGFP和pWK-ITR-eGFP以及阴性对照pWK(-)-eGFP。将构建好的重组质粒转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒,侵染少突神经胶质细胞(OL细胞)后,利用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况。【结果】含有WPRE和ITRs的病毒BV-WK-eGFP、BVWK-ITR-eGFP荧光表达率明显高于阴性对照,且ITRs能够有效延长eGFP的表达时间,比对照组BV-WK(-)-eGFP延长了72 h。经VSV-GED假型化的杆状病毒BV-WK-eGFP、BV-WK-ITR-eGFP转导OL细胞的时间明显缩短,比阴性对照BV-WK(-)-eGFP减少了24 h,并且转导效率分别高出阴性对照25.7%与36.5%。【结论】实验证明了VSV-GED能够有效提高杆状病毒的转导效率,WPRE能够显著增强外源基因的表达效率,ITRs延长外源基因的表达时间。为探究改进型重组杆状病毒在脊椎动物细胞表达外源基因及新型重组活载体疫苗的研发奠定了基础。
- 高冬妮金丽颖葛菁萍王昆安琪平文祥楼庄伟
- 关键词：杆状病毒
- 杆状病毒——高效蛋白表达载体被引量：5
- 2009年
- 杆状病毒（Baculovirus）是昆虫专一性的病原病毒，是目前为止发现最早、研究最多且实用意义很大的昆虫病毒。杆状病毒表达载体系统 （Baculovirus expression vector ,ystem, BEVS）是一个以杆状病毒为外源基因载体，昆虫和昆虫细胞为受体的表达系统。与其他表达系统相比，它具有能容纳较大的外源基因插入；可同时表达多个基因；表达水平高；表达产物可进行包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割和分解等在内的翻译后加工修饰；
- 葛菁萍高冬妮陈娜楼庄伟平文祥
- 关键词：表达载体系统杆状病毒EXPRESSION昆虫病毒VECTOR基因载体
- EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法
- EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，涉及EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法。是要解决目前重组杆状病毒质粒载体转导效率低、表达效率较工业生产要求差距大、表达时间短等问题。方法；一、PCR扩增EF1α基因；二...
- 葛菁萍高冬妮平文祥楼庄伟
- 文献传递
- HD34－1菌株的构建及以其为发酵菌株酿造无醇啤酒的方法
- HD34-1菌株的构建及以其为发酵菌株酿造无醇啤酒的方法，它涉及一种基因工程菌株的构建及无醇啤酒的酿造方法。HD34-1是这样构建的：a、设计5′端、3′端引物；b、扩增ADH基因；c、与表达载体pYC6/CT连接；d、...
- 平文祥葛菁萍宋刚楼庄伟贾树彪吴国峰赵辉周东坡
- 文献传递
