高随
- 作品数：3 被引量：2H指数：1
- 供职机构：华中科技大学同济医学院附属同济医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划“十一五”国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 人重型肝炎相关基因Fas、TNFR1真核表达载体和microRNA表达载体的构建及其体外干预效应的初步研究被引量：1
- 2010年
- 目的构建人Fas(hFas)和人TNFR1(hTNFR1)基因的真核表达质粒pcDNA3.0-hFas、pcDNA3.0-hTN-FR1和microRNA(miRNA)干扰质粒p-hFasmiRNA、p-hTNFR1miRNA,初步验证其在体外细胞系对Fas和TNFR1基因表达的干预效应。方法从人肝癌细胞HepG2细胞中获得模板cDNA,通过PCR扩增出hFas和hTNFR1全长片段,将目的片段通过T载体过渡克隆至表达载体pcDNA3.0,得到重组质粒pcDNA3.0-hFas和pcDNA3.0-hTNFR1。利用miRNA设计软件,针对Fas和TNFR1基因分别设计3对pre-microRNA(pre-miRNA)序列,通过T4连接酶将pre-miRNA克隆至pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA表达载体,同时构建非相关干扰质粒。构建成功的p-hFasmiRNA1、p-hFasmiRNA2、p-hFasmiRNA3和p-hTNFR1miRNA1、p-hTNFR1miRNA2、p-hTNFR1miRNA3分别与pcDNA3.0-hFas和pcDNA3.0-hTNFR1共转染至人293T细胞,通过Real-time PCR和Western blot检测转染48 h后对基因表达的干预效应。结果通过测序鉴定表明Fas和TNFR1基因的真核表达载体和miRNA干扰质粒均构建成功。Real-time PCR结果显示干预组的Fas和TNFR1基因的表达与对照组比较明显减少,抑制效率分别可达到87%和80%。Western blot结果也同样证实干预组的Fas和TNFR1基因的蛋白表达量与对照组比较明显减少。结论成功构建了hFas和hTN-FR1的真核表达载体和microRNA干扰质粒,并初步证实构建的microRNA干扰质粒在细胞水平对hFas和hTNFR1的表达具有特异性的抑制效应。
- 高随习东郭健文严伟明罗小平宁琴
- 关键词：FASTNFR1MICRORNA重型肝炎
- hfg12凝血酶原酶短干扰RNA表达质粒的构建及其效应被引量：1
- 2008年
- 目的探索人fg12凝血酶原酶（hfg12）短干扰RNA（siRNA）在体外对hfg12凝血酶原酶基因表达的干预效应。方法构建产生hfg12短发夹状RNA（shRNA）的载体Phfg12shRNA，将其与hfg12-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合基因表达质粒pEGFPhfg12共转染到中国仓鼠卵母细胞（CHO细胞），转染48h后，倒置荧光显微镜下观察EGFP在CHO细胞中的表达，并通过流式细胞仪检测荧光细胞阳性率。将Phfg12shRNA和hfg12表达质粒pcDNA3．1-hfg12共转染到CHO细胞，通过实时荧光定量PCR和免疫组织化学检测hfg12基因转录和蛋白表达水平的变化。分为4组：共转染P—hfg12shRNA和pcDNA3．1-hfg12为干预组，共转染无关序列shRNA表达质粒和pcDNA3．1-hfg12为非相关干预组，仅转染pcDNA3．1-hfg12为未干预组，不转染任何质粒为空白组。结果在CHO细胞中，含Phfg12shRNA的干预组较未干预组和非相关干预组的绿色荧光强度明显减弱，荧光细胞数明显减少；荧光表达阳性细胞率：干预组α为6．5％±0．2％，未干预组α为40．1％±1．8％，两组比较，Χ^2=8．056，P〈0．01，差异有统计学意义。抑制效率达85．5％。hfg12shRNA显著抑制了hfg12mRNA和蛋白质的表达，干预组hfg12mRNA水平为0．11±0．01，未干预组为0．84±0．06，两组比较，F=10．7，P〈0．01，差异有统计学意义。结论P—hfg12shRNA可在体外高效特异地抑制hfg12基因转录和蛋白的表达，为进一步的体内干扰实验奠定了基础。
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- 关键词：肝功能衰竭RNACHO细胞
- 重型肝炎小鼠模型肝组织凋亡相关蛋白的表达及其促肝细胞凋亡的研究
- 2007年
- 目的研究肝凋亡相关蛋白在重型肝炎小鼠模型肝组织中的表达及其促肝细胞凋亡的作用。方法100PFU鼠3型肝炎病毒（MHV-3）分别感染敏感鼠BALB／cJ系和耐受鼠A／J系，感染后24、48、72h取小鼠肝组织，固定后石蜡包埋并切片，常规HE染色病理诊断计算肝组织炎症活动度积分（HAI）；采用原位缺口末端标记（TUNEL）法检测肝细胞凋亡；免疫组化SP法检测mfg12、Fas、TNFR1蛋白的表达及纤维素的沉积；Western blot法检测小鼠肝组织Bcl-2类蛋白的表达，并计算Bax／Bcl-2的值。结果MHV-3感染后BALB／cJ鼠肝组织出现大量炎性细胞浸润和肝细胞凋亡和坏死，而A／J鼠肝组织炎性反应轻微，且仅有少量肝细胞凋亡和坏死，两者差异有统计学意义（P〈0．01）；感染后24h BALB／cJ鼠肝组织出现大量mfg12、Fas、TNFR1阳性细胞，并有大量纤维素沉积出现，而A／J鼠无阳性细胞和纤维素的沉积；感染后24h BALB／cJ鼠肝组织Bax蛋白的相对表达水平要远高于A／J鼠（P〈0．01），Bcl-2蛋白的相对表达水平差异无统计学意义，BALB／cJ鼠肝组织Bax／Bcl-2值要远高于A／J鼠（P〈0．01）。结论肝组织凋亡相关蛋白的表达及其促肝细胞凋亡在重型肝炎的发病机理中具有重要作用。
- 朱传龙高随罗小平宁琴
- 关键词：重型肝炎纤维介素凋亡
