马怡茗
- 作品数：7 被引量：19H指数：3
- 供职机构：西北农林科技大学生命科学学院更多>>
- 发文基金：中央高校基本科研业务费专项资金国家教育部博士点基金国家重点实验室开放基金更多>>
- 相关领域：生物学轻工技术与工程化学工程更多>>
- 密旋链霉菌Act12遗传转化系统的建立与优化
- 2018年
- 密旋链霉菌(Streptomyces pactum)Act12是分离自黄土高原的1株多效放线菌,具有良好的生防应用价值,为了深入研究与利用,需建立该菌株的高效遗传转化系统。本试验以整合型质粒pSET152为出发质粒,大肠杆菌S17-1为供体,Act12的孢子为受体时,在改良2CMY培养基上进行接合转移,孢子预萌发条件为50℃热激10min,阿普霉素质量浓度为10.0mg/L,覆盖时间为18h,转化效率达到2.079×10^(-5)。以抗阿普霉素基因为目的基因,通过PCR验证,成功地将质粒pSET152转入到Act12中。同时,利用该转化系统,成功敲出Act12基因组中一可能的负调控转录因子spa0520,并获得了次级代谢图谱明显变化的缺失突变株Δspa0520。所构建的Act12遗传转化系统,为后续对其生防活性机理的研究以及深入开发利用奠定了基础。另外,通过培养基的改良发现,Act12在氮源含有NO-3时产孢丰富,为后续研究提供了思路。
- 李晓霞马怡茗文冰洁舒伟学薛泉宏贾良辉颜华
- 关键词：遗传转化系统
- 基于基因组改组技术的角蛋白酶高产菌株选育研究被引量：3
- 2018年
- 【目的】筛选具有高效角蛋白水解活性的微生物,为提高废弃羽毛中角蛋白资源的利用奠定基础。【方法】采用梯度稀释法,以羽毛作为惟一碳氮源对土样中的产角蛋白酶菌株进行筛选,筛选可高效降解羽毛的细菌。通过菌株的形态、生理生化特性以及16S rDNA序列分析,对菌株进行分类鉴定,并探讨其最适发酵条件。利用硫酸二乙酯(DES)和亚硝基胍(NTG)对目的菌株进行诱变,确定最适诱变条件,并进行原生质体融合,通过基因组改组选育角蛋白酶高产菌株。【结果】分离筛选到1株具有较强羽毛降解能力的菌株ZJT01,该菌落圆形凸出,革兰氏染色呈阳性,酪素水解、硝酸盐利用、柠檬酸利用等生理生化试验均呈阳性。结合菌株16S rDNA同源序列比对分析,初步鉴定其为节杆菌(Arthrobactersp.)。菌株ZJT01产角蛋白酶的最适发酵温度和时间分别为32℃和72h。其DES最适用量为9μL/mL,诱变时间为20min;NTG的最适合质量浓度是0.6mg/mL,处理时间为15min。原生质体制备的最佳条件为:溶菌酶终质量浓度10 mg/mL,酶解温度37℃,酶解0.5h。经过硫酸二乙酯(DES)和亚硝基胍(NTG)分别诱变处理,获得角蛋白酶活性提高的菌株DES-2和NTG-2;对其进行3轮基因组改组后,筛选到2株角蛋白酶活性比亲本菌株ZJT01提高了5.48倍的重组菌株,且其产酶活性可稳定遗传。【结论】通过基因组改组技术获得了2株角蛋白酶活性大幅提高的菌株F3-5和F3-6,这2株菌对羽毛的降解效果较亲本菌株ZJT01明显提高,具有较好的应用前景。
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- 关键词：角蛋白酶节杆菌属基因组改组
- 羽毛降解杆状链霉菌S-28遗传转化系统的建立与优化被引量：4
- 2018年
- 【目的】建立羽毛降解杆状链霉菌(Streptomyces bacillaris)S-28的遗传转化系统,并对其进行优化,为该菌株的遗传改造奠定基础。【方法】以大肠杆菌-链霉菌穿梭整合型质粒pSET152为出发质粒,大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1/pSET152为供体,羽毛降解杆状链霉菌S-28孢子为受体进行接合转移试验,并对影响接合效率的培养基种类、MgCl_2浓度、热激温度、预萌发时间、供受体比例和接合转移时间等要素进行优化。【结果】确定筛选羽毛降解杆状链霉菌S-28菌株接合转化子的抗生素为安普霉素≥10μg/mL或卡那霉素≥20μg/mL;成功将pSET152转入到杆状链霉菌S-28中。优化的S-28菌株接合转移条件为:以MS为接合转移最适培养基,MgCl_2浓度为10mmol/L,孢子萌发条件为40℃热激10min且不进行预萌发处理,供受体比例为10∶1,接合转移时间18~20h,此条件下接合转化效率最高达到10-4。【结论】建立并优化了羽毛降解杆状链霉菌S-28的遗传转化系统,接合转化效率最高可达到10^(-4)。
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- 关键词：遗传转化系统
- 角蛋白酶基因gm2886在密旋链霉菌ACT12中的表达及鉴定被引量：6
- 2017年
- 通过生物信息学分析,在本实验室分离得到的1株羽毛高效降解菌微白黄链霉菌Fea-10基因组中发现基因gm2886(GenBank Accession Number:KY368946)可能编码一新的角蛋白酶,通过在该基因5'端和3'端分别连接红霉素抗性基因启动子(PermE)和组氨酸标签编码序列并构建在大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pSET152上,接合转入密旋链霉菌Streptomyces pactum ACT12,从而实现了异源表达,蛋白纯化后对其酶学性质进行了研究。实验结果表明,带有组氨酸标签编码序列的gm2886在密旋链霉菌ACT12中可以表达分泌得到1个大小约为36 kDa的蛋白。多种底物检测表明异源表达得到的重组蛋白GM2886-His6具有蛋白酶活性,可以降解水不溶性的天青角蛋白和羽毛粉;其最适温度和pH分别为50℃和pH 10.0。PMSF可抑制GM2886-His6的酶活,而EDTA不能,说明该酶为丝氨酸蛋白酶。本研究为从分子水平上解析羽毛高效降解菌Fea-10的活性机理,从而进一步开发其应用潜力提供了基础,同时可为该类蛋白酶的研究提供借鉴。
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- 关键词：角蛋白酶异源表达重组酶
- 角蛋白高效降解菌Fea-10的筛选与鉴定被引量：4
- 2017年
- 采用透明圈和完整羽毛降解相结合的方法,从养鸡场长期堆积废羽毛中分离出了一株能高效降解羽毛角蛋白的菌株Fea-10.经16S rDNA序列分析表明,Fea-10属于链霉菌属,与微白黄链霉菌的相似性达99.86%.经形态、生理生化和系统发育树综合鉴定,命名为微白黄链霉菌Fea-10.Fea-10全基因组大小约为7.25 Mb,GC含量为73.36%,其含有丰富的次级代谢产物基因簇.菌株Fea-10发酵培养36 h后角蛋白酶活性达到最高值,最佳培养温度为35℃.
- 颜华柯欣吴佳杨文翰刘亚勇贾良辉马怡茗
- 关键词：角蛋白酶菌株筛选
- 密旋链霉菌Act12中四氢嘧啶合成基因簇的鉴定及其功能分析被引量：2
- 2017年
- 【目的】对生防密旋链霉菌Act12中的四氢嘧啶合成基因簇进行鉴定及功能分析。【方法】对田间生防效果良好的密旋链霉菌Act12进行盐耐受能力检测,采用体积分数80%的乙醇抽提其胞内四氢嘧啶,分别通过TLC和HPLC进行定性及定量检测四氢嘧啶。通过Act12全基因组分析,克隆得到Act12中四氢嘧啶生物合成基因簇ectABC,将其与表达载体pET-28a连接,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,检测工程菌株的盐耐受能力。【结果】密旋链霉菌Act12可在NaCl质量分数为0%~10.0%的条件下生长,且能够生产相关耐盐相容性溶质四氢嘧啶。当NaCl质量分数为2.5%时,密旋链霉菌Act12胞内的四氢嘧啶积累量达到最大值,为72.39mg/L。生物信息学分析结果表明,组成ectABC基因簇的3个基因ectA、ectB、ectC位于同一个操纵子上,分别编码二氨基丁酸乙酰基转移酶、二氨基丁酸氨基转移酶和四氢嘧啶合成酶。通过克隆得到长2 408bp的ectABC基因簇,并使其成功在大肠杆菌中实现异源表达,通过Ni柱纯化得到了EctA蛋白。但含pET28a-ectABC的大肠杆菌BL21(DE3)在本试验条件下,其盐耐受能力并无明显改善。【结论】生防链霉菌Act12中存在四氢嘧啶合成基因簇ectABC,且能够在大肠杆菌中成功异源表达。
- 高波马怡茗洪煜舒伟学薛泉宏颜霞颜华贾良辉
- 关键词：链霉菌相容性溶质四氢嘧啶
- 一株缬草根际稀有放线菌的分离鉴定及其天然产物生物合成基因的筛查
- 2016年
- 采用梯度稀释涂布平板法分离缬草根际土壤中的放线菌,从高氏一号培养基上分离得到1株放线菌BJA-103,对该菌形态特征、培养特征、生理生化特征及16SrDNA基因序列进行鉴定,并用简并PCR方法对其多种天然产物生物合成关键酶基因进行筛查。经分类鉴定,初步确定BJA-103为Amycolatopsis coloradensis的一个菌株;PCR筛查结果显示,该菌株含有非核糖体肽合酶(NRPS)、Ⅰ型聚酮合酶(PKS-Ⅰ)、Ⅱ型聚酮合酶(PKS-Ⅱ)以及糖肽类抗生素合成关键酶P450单加氧酶的基因。
- 安晓英马怡茗刘香香周童娜颜华贾良辉
- 关键词：稀有放线菌RDNA
