郭军玲
- 作品数：6 被引量：14H指数：3
- 供职机构：江南大学生物工程学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金江苏省产学研联合创新资金项目国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学轻工技术与工程化学工程更多>>
- Tyr78-loop对鱼腥藻来源苯丙氨酸脱氨酶活性的影响
- 2018年
- 【背景】MIO(Methylidene-imidazol-5-one)依赖型酶中,催化因子Tyr所在Loop(Tyr78-loop)的灵活性显著影响酶学性质。【目的】探讨Tyr78-loop对鱼腥藻来源苯丙氨酸脱氨酶酶活的影响,以提高其反应活性。【方法】将该酶的Tyr78-loop进行分子改造,筛选出酶活提高的突变体,并对突变体的酶学性质进行研究。【结果】突变体S73N、E95V、E95K和S73N/E95K在37°C、pH 8.5下比活分别比原酶提高了34%、30%、18%和35%。蛋白三维结构模拟推测在突变体S73N、E95V和E95K中,位于α螺旋与Tyr78-loop交界处的Asn73、Val95和Lys95与附近氨基酸的氢键作用力数目减少,一定程度上增加了Tyr78-loop的柔性。【结论】Ser73位和Glu95位氨基酸的突变增加了Tyr78-loop的灵活性,提高了苯丙氨酸脱氨酶的酶活。
- 郭军玲张帆黄楠黄楠周丽
- 关键词：酶活定点突变稳定性
- 通过串联启动子实现纳豆激酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达被引量：4
- 2016年
- 本研究通过串联启动子方式实现纳豆激酶在枯草芽孢杆菌WB800中的高效分泌表达。通过对几种现有报道的强启动子的比较并对其进行串联操作,确定生产纳豆激酶的最优启动子及纳豆激酶的最高产量。本研究首先在枯草芽孢杆菌WB800中成功构建五种含不同强启动子的重组质粒p SG101(P_(HpaII)),p SG102(PBcapr E),p SG103(Plux S),p SG104(Pgsi B)和p SG105(Pyxi E),实现纳豆激酶分泌表达,并对其纤溶活性进行测定。结果表明,启动子P_(HpaII)介导的纳豆激酶纤溶活性(110.80 FU/m L)明显优于其他四种启动子。通过对启动子P_(HpaII)进行多次串联,成功构建质粒p SG106(P_(HpaII)-P_(HpaII)),p SG107(P_(HpaII)-P_(HpaII)-P_(HpaII))和p SG108(P_(HpaII)-P_(HpaII)-P_(HpaII)-P_(HpaII))。数据显示,菌株Bacillus subtilis WB800/p SG107(P_(HpaII)-P_(HpaII)-P_(HpaII))纳豆激酶产量最高为213.30 FU/m L,相比单个启动子P_(HpaII),提高了92.51%。通过对五种强启动子的比较以及对其进行串联操作,成功实现纳豆激酶在枯草芽孢杆菌WB800的高效表达,纤溶活性最高为213.30 FU/m L,与现有相关报道相比有明显优势。
- 葛春蕾刘中美崔文璟周丽郭军玲胡云峰周哲敏
- 关键词：纳豆激酶分泌表达
- 腈水合酶的稳定性改造研究进展被引量：3
- 2020年
- 腈水合酶(nitrile hydratase,NHase,EC 4.2.1.84)是一种金属酶,能催化腈类物质转化为相应的酰胺类物质,广泛应用于高附加值酰胺类化合物的生产。但由于NHase较差的稳定性,在催化反应过程中受到温度、产物浓度等影响而逐渐失活,这严重影响了NHase的工业化应用。近年来,针对这个问题,研究者通过酶分子改造,在NHase的稳定性提高方面取得了一定进展。本文中,笔者主要对近年来提高NHase稳定性的分子改造方面取得的进展进行总结,包括基于生物信息学解析的盐桥增设、自由能降低、同源片段重组和基因融合等策略。这些成果不仅推动了生物催化法生产酰胺类化合物的发展,还将为NHase蛋白质改造工程提供理论支持。
- 沈瑞华郭军玲周哲敏
- 关键词：腈水合酶生物催化蛋白质工程
- 高分子量腈水合酶工程菌生产烟酰胺的工艺建立被引量：5
- 2018年
- 为提高表达玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous J1)来源的高分子量腈水合酶大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET-24a(+)-nhh Brbs Arbs G(BAG)的菌体酶活,建立了合适的烟腈全细胞催化工艺以及重组工程菌的高密度发酵工艺。采用正交试验L_9(3~4)对摇瓶培养基中各组分进行优化,比较烟腈底物流加和底物分批补料工艺,对重组菌进行分批补料高密度发酵培养。培养基优化后其菌体生物量提高到4.42 gDCW/L,细胞比酶活提高到30.91 U/mgDCW;与烟腈底物流加相比,烟腈分批补料工艺更适合烟酰胺的生产,通过此工艺的反应,摇瓶发酵后的BAG能够生产390 g/L烟酰胺;对BAG进行5 L发酵罐分批补料扩大培养,菌体生物量最高达到73.97 gDCW/L(OD600=200),细胞比酶活最高为42.70 U/mgDCW,单位发酵液酶活最高为2 813 U/mL,用较高密度的发酵罐培养后重组菌进行烟腈催化反应,产物质量浓度能达到537 g/L,是已报道的大肠杆菌重组表达腈水合酶产烟酰胺所得终质量浓度的最高水平。
- 郭军玲王哲刘中美周哲敏
- 关键词：腈水合酶全细胞催化高密度发酵
- 雅致放射毛霉羧肽酶Y的基因克隆、表达与酶学性质研究被引量：3
- 2017年
- 本研究从雅致放射毛霉中克隆、表达和纯化羧肽酶Y(CPY),体外激活后检测其酶学性质。本文筛选并鉴定了一株腐乳发酵菌株,命名为雅致放射毛霉PEP001(Actinomucor elegans PEP001)。以相近种族来源的真菌羧肽酶Y保守序列设计简并引物调取部分目的基因序列,利用末端扩增技术(RACE)分别获得3’与5’端基因全长,克隆获得羧肽酶Y基因,全长为1557 bp,编码518 aa。将其酶原(pro CPY)在大肠杆菌Rosetta中重组表达,产物为包涵体;在毕赤酵母GS115中成功分泌表达pro CPY,产量为151.20±10.20mg/L。通过体外激活与纯化,获得电泳纯的成熟羧肽酶Y。成熟羧肽酶Y最适pH为6.0,最适温度为45℃,在40℃下有较高稳定性,在60℃下很快失活,在pH 4.0~7.0下都有较高的稳定性。本文中雅致放射毛霉PEP001羧肽酶Y为首次报道,为进一步研究其应用打下一定基础。
- 纪海兵刘中美郭军玲周哲敏
- 关键词：雅致放射毛霉酶学性质
- 红球菌低分子量型腈水合酶的异源激活及激活子的结构域功能
- 2020年
- 腈水合酶激活子具有亚基自身交换伴随子或者金属离子伴随子的功能,能够辅助腈水合酶摄取金属离子,对于腈水合酶的活性表达必不可少。与腈水合酶自身相比,激活子的序列保守性低,研究其激活作用的特点,探索其结构与功能之间的关系,对于理解腈水合酶的成熟机制具有重要意义。将红球菌Rhodococcus rhodochrous J1低分子量型腈水合酶L-NHase分别与4种异源激活子组合共表达,测定异源激活子对L-NHase的激活作用,进一步对激活子进行序列分析和结构模拟,并研究关键结构域的功能。结果表明,4种异源激活子均能激活L-NHase,但激活后L-NHase的比酶活存在差异,激活子A对L-NHase的激活程度最高,激活后的L-NHase比酶活为出发酶的97.79%;激活子G对L-NHase的激活程度最低,激活后的L-NHase比酶活为出发酶的23.94%。激活子E和激活子G具有保守结构域TIGR03889,缺失其中部分序列会使两者的激活作用基本丧失。将激活子G的N端序列替换为激活子E的N端序列,并将激活子E的C端序列添加至激活子G的C端,能够使L-NHase的比酶活提高178.40%。激活子的激活作用具有普遍性和特异性,其保守结构域对激活作用至关重要,同时N端结构域和C端结构域也对激活作用产生重要影响。
- 王甜忆程中一郭军玲夏媛媛刘中美周哲敏
- 关键词：腈水合酶蛋白质结构域
