魏翠
- 作品数：2 被引量：3H指数：1
- 供职机构：徐州市中心医院更多>>
- 发文基金：江苏省自然科学基金国家自然科学基金徐州市科技局社会发展基金更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 应用Ad Easy腺病毒载体系统构建人肌浆网钙离子ATP酶2a(SERCA2a)被引量：1
- 2010年
- 目的:利用Adeasy腺病毒表达系统构建含人肌浆网钙离子ATP酶2a(SERCA2a)基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组腺病毒。方法:将人SERCA2a基因全长cDNA(3700bp)插入到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,成功构建pAd-TrackCMVSERCA2a重组质粒,经PmeI酶切线性化,采用电击法转入到已含Adeasy质粒的电感受态菌BJ5183进行重组。挑选同源重组质粒,PacI酶切线性化转染HEK293细胞包装成重组腺病毒颗粒,荧光检测有绿色荧光蛋白表达。将重组病毒和SD大鼠心肌细胞共培养,western-blot检测SERCA2a可以在大鼠心肌细胞过表达且影响了胞内SERCA2a的活性。结果:成功包装含人SERCA2a基因的重组腺病毒,并可以有效感染SD大鼠心肌细胞。结论:利用新型腺病毒载体在短时间内成功构建了携带有人SERCA2a基因的腺病毒,为以后进一步研究人SERCA2a基因治疗提供了新途径。
- 吕茜魏翠张清林王洁宫海滨
- 关键词：转染
- 应用Ad Easy载体系统构建人β_2-AR基因重组腺病毒被引量：2
- 2009年
- 目的:利用Ad easy腺病毒表达系统构建含人β2-肾上腺素能受体(β2-AR)基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组腺病毒。方法:将β2-AR全长cDNA插入到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,构建pAdTrackCMV-β2AR重组质粒,经Pme I酶切线性化后经电击法转入含Ad easy质粒的电感受态菌BJ5183进行重组。挑选同源重组质粒,Pac I酶切线性化转染HEK293细胞包装成重组腺病毒颗粒。将重组病毒和SD大鼠心肌细胞共培养,western-blot检测β2-AR的表达。结果:琼脂糖凝胶电泳显示在1242bp处有特异性条带后被克隆至腺病毒穿梭质粒。重组穿梭载体经Hind III和Xba I限制性酶切可以得到目的条带并经测序证实。电击法转化BJ5183所得候选重组子经PacI酶切后得到30Kb腺病毒基因组片段和4.5Kb氨苄抗性片段,证实获得同源重组质粒。转染293细胞可以看到绿色荧光蛋白,以MOI100转染SD大鼠心肌细胞发现携带β2-AR的腺病毒可以在心肌细胞中过表达。结论:利用新型腺病毒载体在短时间内成功构建了携带有人β2-AR基因的腺病毒,为进一步研究人β2-AR基因治疗奠定了基础。
- 宫海滨魏翠张清林吕茜
- 关键词：AD心肌细胞
