袁风娇
- 作品数：8 被引量：15H指数：2
- 供职机构：江南大学食品学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金江苏省普通高校研究生科研创新计划项目上海市科委科研计划项目更多>>
- 相关领域：轻工技术与工程生物学化学工程更多>>
- 定点饱和突变提高Lactobacillus casei L-乳酸脱氢酶对苯丙酮酸的催化效率被引量：2
- 2018年
- 【背景】光学纯L-苯乳酸是一种天然防腐剂,也是一种高附加值的手性分子,在食品、制药和材料等领域有广阔的应用前景。本实验室已发现来源于Lactobacillus casei CICIM B1192的NADH依赖型L-乳酸脱氢酶(L-LcLDH)可不对称还原苯丙酮酸制备L-苯乳酸,但其活性较低。为提高L-LcLDH催化苯丙酮酸的催化效率,构建了一个单突变体L-LcLDH^(Q88R),其催化效率kcat/Km是L-LcLDH的4.9倍。【目的】为进一步提高L-LcLDH^(Q88R)催化苯丙酮酸的催化效率,采用饱和突变技术将位于L-LcLDH^(Q88R)底物结合口袋附近的氨基酸残基Ile^(229)随机替换为其他氨基酸,以获得活性更高的优良突变体。【方法】以重组表达质粒p ET-22b-LcldhQ88R为模板,采用全质粒PCR技术对L-LcLDH^(Q88R)基因(LcldhQ88R)中编码Ile^(229)的密码子实施饱和突变,构建突变转化子文库。以催化苯丙酮酸的活性为指标,从文库中筛选出优良的突变转化子。【结果】突变转化子(Escherichia coli/Lcldh^(Q88R/I229Q))表达出一种由Arg和Gln分别替换了Gln88和Ile^(229)的双突变体L-LcLDH^(Q88R/I229Q)。重组表达产物L-LcLDH^(Q88R/I229Q)的酶学性质分析表明:L-LcLDH^(Q88R/I229Q)的比活性是L-LcLDH的18.5倍,是L-LcLDH^(Q88R)的2.3倍;其催化效率分别为后两者的6.8倍和1.4倍。L-LcLDH突变前后的温度和pH特性改变不大。根据分子对接结果推测出,双突变Q88R/I229Q导致L-LcLDH的底物结合口袋的入口变大和构型的变化可能对其催化活性的提高发挥了重要作用。【结论】双突变Q88R/I229Q显著提高了L-LcLDH的活性和催化效率,使得L-LcLDH^(Q88R/I229Q)在不对称还原苯丙酮酸制备L-苯乳酸中成为有潜力的工具酶。
- 李雪晴刘艳袁风娇李剑芳邬敏辰
- 关键词：LACTOBACILLUSCASEIL-乳酸脱氢酶苯丙酮酸
- CBM融合位置对AuMan5A酶学性质的影响被引量：1
- 2019年
- 为探讨碳水化合物结合结构域(CBM)不同融合位置对Aspergillus usamii 5家族β-甘露聚糖酶AuMan5A酶学性质的影响,将Thermotoga maritima 27家族CBM分别融合至其C和N末端,构建出融合酶基因Auman5A-cbm27和cbm27-Auman5A。将Auman5A和融合酶基因分别在Pichia pastoris GS115中表达,分析比较表达产物AuMan5A、AuMan5A-CBM27和CBM27-AuMan5A的酶学性质。结果表明:AuMan5A、AuMan5A-CBM27和CBM27-AuMan5A的最适温度Topt分别为70、70℃和60℃;其中AuMan5A-CBM27在68℃及以下保温1 h残余酶活均大于85%,与原酶相比,其热稳定性提高了约8℃,而CBM27-AuMan5A在58℃及以下保持稳定,与原酶相比,降低了2℃。3种酶的最适pH均为4.0;AuMan5A在pH值2.5~7.5范围内保持稳定,2种融合酶在pH 2.0~9.0内均能保持稳定。与AuMan5A相比,AuMan5A-CBM27和CBM27-AuMan5A对角豆胶的Km分别降低了45.0%和26.3%。通过比较3种酶的酶学性质,证实CBM不同融合位置对AuMan5A酶学性质具有重要影响。
- 袁风娇王春娟李雪晴李剑芳邬敏辰
- 关键词：Β-甘露聚糖酶酶学性质
- β-甘露聚糖酶AuMan5Aloop/H321G在乳酸克鲁维酵母中的高效表达被引量：2
- 2019年
- 为制备食品级β-甘露聚糖酶,将来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)的糖苷水解酶5家族β-甘露聚糖酶突变体基因(AuMan5Aloop/H321G)克隆至表达质粒pKLAC1信号肽α-MF下游,构建重组表达质粒pKLAC1-AuMan5Aloop/H321G,并电转化乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)GG799。采用半乳糖诱导表达和酶活性分析获得了高水平表达的重组β-甘露聚糖酶突变酶(reAuMan5Aloop/H321G)的转化子GG799/AuMan5Aloop/H321G,其产酶活力为54.9 U/mL。SDS-PAGE分析显示,reAuMan5Aloop/H321G的表观相对分子质量约为55 000。经YPG培养基初始pH、摇瓶装液量以及诱导剂的种类、初始质量浓度和添加方式的初步优化,GG799/AuMan5Aloop/H321G所产酶活力较工艺优化前提高了254.6%,从而实现了reAuMan5Aloop/H321G在乳酸克鲁维酵母中的高效表达。
- 唐诗涵李雪晴袁风娇李剑芳邬敏辰
- 关键词：Β-甘露聚糖酶乳酸克鲁维酵母诱导剂发酵工艺
- 不对称还原苯丙酮酸的L-乳酸脱氢酶L-LcLDH2的表达及生物信息学分析被引量：1
- 2019年
- 以干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增一种L-乳酸脱氢酶(L-LcLDH2)的编码基因Lcldh2;借助表达质粒pET-28a(+)将Lcldh2在大肠杆菌BL21(DE3)中实施异源表达。实验结果表明,细胞超声破碎液中L-LcLDH2催化苯丙酮酸的酶活性为47 U/mg总蛋白质;采用重组E.coli/Lcldh2全细胞催化苯丙酮酸还原,所获产物L-苯乳酸的对映体过量(eep)值>99%。生物信息学分析表明,Lcldh2开放阅读框长906 bp,编码含301个氨基酸的L-LcLDH2,预测其相对分子质量和等电点分别为32585和5.5;L-LcLDH2含有典型的NAD+结合位点序列(GXGXXG),属于NAD依赖型L-乳酸脱氢酶,且是一种非分泌、非跨膜、无信号肽和定位于细胞质的酶蛋白。L-LcLDH2的获得为生物法制备高光学纯L-苯乳酸提供了新的酶源。
- 李雪晴袁风娇刘艳李剑芳邬敏辰
- 关键词：LACTOBACILLUSCASEIL-乳酸脱氢酶苯丙酮酸生物信息学
- Y13F定点突变改良米曲霉中温木聚糖酶的耐热性被引量：2
- 2016年
- 为改良米曲霉(Aspergillus oryzae)糖苷水解酶11家族木聚糖酶AoXyn11A的耐热性,将其Tyr^(13)(Y13)置换为Phe(F)。基于AoXyn11A与同一家族7种耐热木聚糖酶一级结构的多序列同源比对及其三维结构的同源建模和分子动力学模拟,设计了一种突变酶AoXyn11A^(Y13F);以重组质粒p PIC9K-Aoxyn11A为模板,采用PCR技术将AoXyn11A基因(Aoxyn11A)中编码Y13的密码子TAC突变为F的TTC,构建了一种突变酶基因(Aoxyn11A^(Y13F));分别将Aoxyn11A和Aoxyn11A^(Y13F)在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中实施了表达,并对重组表达产物AoXyn11A和AoXyn11A^(Y13F)的耐热性进行了分析。结果表明:突变酶的最适温度T_(opt)由突变前的50℃提高到55℃;AoXyn11A^(Y13F)在50℃的半衰期t_(1/2)^(50)为95 min,较AoXyn11A(t_(1/2)^(50)=6 min)延长了约15倍。由此经Y13F定点突变显著改良了野生型木聚糖酶的耐热性。
- 吴芹胡蝶李雪晴袁风娇李剑芳邬敏辰
- 关键词：定点突变疏水相互作用
- 杂合β-甘露聚糖酶AuMan5A^(loop)的H321对其酶学性质的影响
- 2017年
- 目的:将loop置换杂合β-甘露聚糖酶AuMan5A^(loop)的H321突变回野生型酶AuMan5A对应的Gly,以分析杂合酶的酶学性质与H321的相关性。方法:采用大引物PCR技术将AuMan5A^(loop)基因(Auman5Aloop)编码H321的密码子CAC突变为Gly的GGT,构建突变酶基因Auman5A^(loop/H321G);借助表达质粒pPICZαA将该突变酶基因在Pichia pastoris GS115中实施表达,并分析重组表达产物AuMan5A^(loop) H321G的酶学性质。结果:AuMan5A^(loop/H321G)置换前后的最适温度T_(opt)均为75℃,高于AuMan5A的65℃;AuMan5A^(loop/H321G)在70℃的半衰期t_(1/2)^(70)为300 min,介于AuMan5A(10 min)和AuMan5A^(loop)(480 min)之间;AuMan5A^(loop/H321G)比活性分别为AuMan5A和AuMan5A^(loop)的12.8和1.43倍;催化效率k_(cat)/K_m为后两者的14.1和1.12倍。结论:通过H321G置换及对3种酶的温度特性、比活性和催化效率的测定及比较,证实了H321对AuMan5A^(loop)的酶学性质有一定的影响。
- 李雪晴袁风娇程建青董运海李剑芳邬敏辰
- 关键词：Β-甘露聚糖酶杂合酶定点突变突变酶酶学性质
- 氧化三酰甘油聚合物的细胞毒性研究被引量：6
- 2012年
- 食用植物油经深度氧化劣败会产生高浓度的氧化三酰甘油聚合物(TGP),TGP是氧化三酰甘油(oxidized triacylglycerol,ox-TG)的二聚体(oxidized triacylglycerol dimers,TGD)和寡聚体(oxidized triacylglycerol oligomers,TGO)的总称。研究旨在初步评价TGD和TGO的生物学毒性。以不同浓度的TGP作用于体外培养的巨噬细胞,分别检测细胞的增殖能力、中性红吞噬能力和LDH释放量,同时采用激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡、流式细胞术检测细胞内ROS水平。结果显示,TGP显著抑制巨噬细胞的增殖能力和中性红吞噬能力,显著提高细胞内ROS水平和LDH释放量,导致巨噬细胞的凋亡。因此,初步证实TGP具有明显的生物学毒性,对机体的免疫功能有损伤作用。
- 曹文明曹虹晖薛斌陈凤香袁风娇施恒飞张伟云
- 关键词：巨噬细胞毒性
- Lactobacillus plantarum苯丙酮酸还原酶的异源表达及其在苯乳酸制备中的应用被引量：1
- 2017年
- 构建产苯丙酮酸还原酶的基因工程菌E.coli/ppr,优化其目的蛋白表达条件,并利用全细胞催化制备光学纯的D-苯乳酸。以Lactobacillus plantarum的基因组DNA为模板,经PCR扩增出一种编码苯丙酮酸还原酶的基因(ppr),并将其在大肠杆菌BL21中进行表达。以苯丙酮酸为底物,通过单因素和正交试验优化诱导表达条件,然后对E.coli/ppr全细胞制备苯乳酸的工艺进行研究。结果表明:E.coli/ppr在IPTG终浓度为0.5 mmol/L,20℃诱导8 h时具有最高的苯丙酮酸还原酶活性。由其催化制备苯乳酸的最佳条件为:反应温度40℃,反应初始pH 6.5,葡萄糖浓度20 mmol/L。在上述条件下增加苯丙酮酸的浓度至25 mmol/L,5 h后苯乳酸的最终产率达到98.4%,产物D-苯乳酸光学纯度ee>99.9%。
- 袁风娇李雪晴李剑芳刘艳邬敏辰
- 关键词：苯乳酸全细胞催化
