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李剑芳: 作品数：56 被引量：353H指数：9; 供职机构：江南大学食品学院更多>>; 发文基金：国家自然科学基金江苏省普通高校研究生科研创新计划项目中国博士后科学基金更多>>; 相关领域：轻工技术与工程生物学化学工程农业科学更多>>

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宇佐美曲霉E001菌株XynⅡ基因的克隆和融合表达被引量：1: 2007年; 以宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001株基因组DNA为模板,PCR扩增了编码木聚糖酶Ⅱ(Xyla-nases,XynⅡ)成熟肽的DNA片段。构建重组克隆质粒pUCm-T-XynⅡ,并以其为摸板,PCR扩增XynⅡ成熟肽的cDNA片段(555 bp),连接于表达质粒pGEX-5X-3的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点间,构建重组表达质粒pGEX-5X-3-XynⅡ,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行检测。结果表明,XynⅡDNA中存在1个内含子,长度为51 bp;融合蛋白GST-XynⅡ主要以包涵体形式存在,相对分子质量约为50 ku,IPTG诱导1,3和5 h融合蛋白GST-XynⅡ的表达量分别约占菌体总蛋白量的12.6%,25.3%和32.1%。表明宇佐美曲霉E001菌株XynⅡ基因融合表达成功。; 邬敏辰周晨妍李剑芳; 关键词：宇佐美曲霉基因克隆

定点饱和突变提高Lactobacillus casei L-乳酸脱氢酶对苯丙酮酸的催化效率被引量：1: 2018年; 【背景】光学纯L-苯乳酸是一种天然防腐剂,也是一种高附加值的手性分子,在食品、制药和材料等领域有广阔的应用前景。本实验室已发现来源于Lactobacillus casei CICIM B1192的NADH依赖型L-乳酸脱氢酶(L-LcLDH)可不对称还原苯丙酮酸制备L-苯乳酸,但其活性较低。为提高L-LcLDH催化苯丙酮酸的催化效率,构建了一个单突变体L-LcLDH^(Q88R),其催化效率kcat/Km是L-LcLDH的4.9倍。【目的】为进一步提高L-LcLDH^(Q88R)催化苯丙酮酸的催化效率,采用饱和突变技术将位于L-LcLDH^(Q88R)底物结合口袋附近的氨基酸残基Ile^(229)随机替换为其他氨基酸,以获得活性更高的优良突变体。【方法】以重组表达质粒p ET-22b-LcldhQ88R为模板,采用全质粒PCR技术对L-LcLDH^(Q88R)基因(LcldhQ88R)中编码Ile^(229)的密码子实施饱和突变,构建突变转化子文库。以催化苯丙酮酸的活性为指标,从文库中筛选出优良的突变转化子。【结果】突变转化子(Escherichia coli/Lcldh^(Q88R/I229Q))表达出一种由Arg和Gln分别替换了Gln88和Ile^(229)的双突变体L-LcLDH^(Q88R/I229Q)。重组表达产物L-LcLDH^(Q88R/I229Q)的酶学性质分析表明:L-LcLDH^(Q88R/I229Q)的比活性是L-LcLDH的18.5倍,是L-LcLDH^(Q88R)的2.3倍;其催化效率分别为后两者的6.8倍和1.4倍。L-LcLDH突变前后的温度和pH特性改变不大。根据分子对接结果推测出,双突变Q88R/I229Q导致L-LcLDH的底物结合口袋的入口变大和构型的变化可能对其催化活性的提高发挥了重要作用。【结论】双突变Q88R/I229Q显著提高了L-LcLDH的活性和催化效率,使得L-LcLDH^(Q88R/I229Q)在不对称还原苯丙酮酸制备L-苯乳酸中成为有潜力的工具酶。; 李雪晴刘艳袁风娇李剑芳邬敏辰; 关键词：LACTOBACILLUS CASEI L-乳酸脱氢酶苯丙酮酸

饲用硒酵母制备过程中硒梯度添加方法的研究被引量：8: 2004年; 硒酵母制备过程中 ,当环境硒质量浓度大于 10 μg/ml时 ,可根据酵母生长的几个不同阶段采用硒梯度增加法。保持发酵初期培养基中硒浓度在较低水平 ,随着酵母生长繁殖加快 ,对数生长期来临 ,硒浓度再提高至实验确定的水平(2 5 μg/ml)。这不仅能提高硒酵母产量 15 .2 % ,而且还能有效地避免红硒沉淀出现 ,使成品酵母有机硒含量达 90 %以上。; 陆建安李剑芳袁信华张晓鸣; 关键词：硒酵母有机硒饲料添加剂

黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶的发酵工艺被引量：24: 2002年; 从数十株实验室保藏和土壤分离的黑曲霉菌株中 ,通过筛选和物理化学诱变 ,获得了 1株黑曲霉酸性 β 甘露聚糖酶高产菌株 AspergillusnigerL 76 1。经正交试验选出的最佳产酶培养基为 :魔芋粉 4 0 % ,豆饼粉 2 5 % ,玉米浆 1 5 % ,CaCl2 1 0 % ,KH2 PO4 0 1% ,Na2 HPO40 1% ,MgSO4 ·7H2 O 0 1% ,pH6 0。优化的发酵条件为 :装液量 30mL/2 5 0mL三角瓶 ,摇床转速2 2 5r/min ,发酵温度和时间分别为 ( 31± 1)℃和 84h。在上述条件下 ,L 76 1的 β 甘露聚糖酶发酵酶活力达 32 0U/mL。; 李剑芳王斌林邬敏辰; 关键词：Β-甘露聚糖酶黑曲霉菌株选育发酵工艺

β—甘露聚糖酶高产菌株的双重诱变育种被引量：9: 2007年; 以实验室保藏的一株β-甘露聚糖酶产生菌黑曲霉(Aspergillus niger)LW-1为原始出发菌株,采用自然分离、微波与甲基磺酸乙酯(EMS)双重诱变,经平皿透明圈粗筛、摇瓶初筛和复筛以及斜面传代稳定性实验,获得了一株高产、稳产β-甘露聚糖酶的突变株WS-2007。结果表明,该突变株摇瓶液体发酵产β-甘露聚糖酶活性高达3261U/mL,为原始出发菌株(1027U/mL)的3.18倍。; 盛金萍邬敏辰张树飞朱劼李剑芳; 关键词：Β-甘露聚糖酶微波辐照 EMS处理

微生物学课程的教学改革及其实践被引量：4: 2001年; 通过更新教学内容和采用现代化教学手段 ,加强学生技能训练等的改革实践 ,转过窄的专业教育为素质教育 ,变注重灌输的模式为知识、能力、素质并重的人才培养模式。实践表明 ,教学内容的丰富、教学方法的革新和教学手段的改善提高了教学质量和效果 ,提高了学生的学习兴趣 ,拓展了学生的知识面 ,有利于学生对后继课程的学习兴趣。; 孙震张灏李剑芳; 关键词：微生物学教学改革教学方法教学内容高校

β-甘露聚糖酶AuMan5Aloop/H321G在乳酸克鲁维酵母中的高效表达被引量：2: 2019年; 为制备食品级β-甘露聚糖酶,将来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)的糖苷水解酶5家族β-甘露聚糖酶突变体基因(AuMan5Aloop/H321G)克隆至表达质粒pKLAC1信号肽α-MF下游,构建重组表达质粒pKLAC1-AuMan5Aloop/H321G,并电转化乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)GG799。采用半乳糖诱导表达和酶活性分析获得了高水平表达的重组β-甘露聚糖酶突变酶(reAuMan5Aloop/H321G)的转化子GG799/AuMan5Aloop/H321G,其产酶活力为54.9 U/mL。SDS-PAGE分析显示,reAuMan5Aloop/H321G的表观相对分子质量约为55 000。经YPG培养基初始pH、摇瓶装液量以及诱导剂的种类、初始质量浓度和添加方式的初步优化,GG799/AuMan5Aloop/H321G所产酶活力较工艺优化前提高了254.6%,从而实现了reAuMan5Aloop/H321G在乳酸克鲁维酵母中的高效表达。; 唐诗涵李雪晴袁风娇李剑芳邬敏辰; 关键词：Β-甘露聚糖酶乳酸克鲁维酵母诱导剂发酵工艺

饲用硒酵母制备工艺条件的优化被引量：19: 2002年; 以啤酒酵母为菌种、添加亚硒酸钠的麦芽汁为培养基。从发酵液中硒浓度、发酵培养时间和接种量等方面研究了硒酵母发酵制备的效果。通过正交试验确定的最优工艺条件是:①发酵温度28℃;②接种量10%;③发酵培养基中的硒浓度25μg/ml;④发酵培养时间30h。经测定成品酵母的硒含量可达650mg/kg左右。; 陆建安李剑芳袁信华; 关键词：硒酵母有机硒饲料

不对称还原苯丙酮酸的L-乳酸脱氢酶L-LcLDH2的表达及生物信息学分析被引量：1: 2019年; 以干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增一种L-乳酸脱氢酶(L-LcLDH2)的编码基因Lcldh2;借助表达质粒pET-28a(+)将Lcldh2在大肠杆菌BL21(DE3)中实施异源表达。实验结果表明,细胞超声破碎液中L-LcLDH2催化苯丙酮酸的酶活性为47 U/mg总蛋白质;采用重组E.coli/Lcldh2全细胞催化苯丙酮酸还原,所获产物L-苯乳酸的对映体过量(eep)值>99%。生物信息学分析表明,Lcldh2开放阅读框长906 bp,编码含301个氨基酸的L-LcLDH2,预测其相对分子质量和等电点分别为32585和5.5;L-LcLDH2含有典型的NAD+结合位点序列(GXGXXG),属于NAD依赖型L-乳酸脱氢酶,且是一种非分泌、非跨膜、无信号肽和定位于细胞质的酶蛋白。L-LcLDH2的获得为生物法制备高光学纯L-苯乳酸提供了新的酶源。; 李雪晴袁风娇刘艳李剑芳邬敏辰; 关键词：LACTOBACILLUS CASEI L-乳酸脱氢酶苯丙酮酸生物信息学

融合β-甘露聚糖酶基因的构建、表达及酶学性质的分析被引量：2: 2016年; 宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)YL-01-78的糖苷水解酶5家族β-甘露聚糖酶(Au Man5A)是一种仅含催化域(CM)的单结构蛋白。为改善其酶学性质,基于理性设计将海栖热胞菌(Thermotoga maritima)MSB8的27家族碳水化合物结合域(CBM27)融合至Au Man5A的C-端,并采用重叠PCR技术构建融合酶基因Auman5A-cbm27。分别将Auman5A-cbm27和Auman5A在毕赤酵母GS115中进行表达,对重组表达产物re Au Man5A-CBM27和re Au Man5A进行纯化和酶学性质测定。结果表明,re Au Man5A-CBM27和re Au Man5A的最适温度均为68℃;两者分别在68和60℃及以下稳定。同时,前者较后者具有更广泛的p H稳定范围。re Au Man5ACBM27对角豆胶的Km值由融合前的1.7 mg/m L降至0.7 mg/m L,表明Au Man5A的底物亲和力得到了提高。; 王春娟李剑芳唐诗涵董运海邬敏辰; 关键词：Β-甘露聚糖酶热稳定性

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