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定点突变改善β-甘露聚糖酶AuMan5A的酶学性质被引量：1: 2017年; 基于糖苷水解酶5家族(GHF5)β-甘露聚糖酶一级、三维结构的比对和分析,对宇佐美曲霉GHF5β-甘露聚糖酶AuMan5A的关键位点氨基酸实施定点突变以获得酶学性质优良的突变酶AuMan5A^(G320D)。采用大引物PCR技术将AuMan5A基因(Auman5A)中编码Gly^(320)的密码子GGT突变为Asp^(320)的GAC,构建出突变酶基因Auman5A^(G320D)。分别将Auman5A和Auman5A^(G320D)在毕赤酵母GS115中进行了表达,分析了表达产物AuMan5A和AuMan5A^(G320D)的酶学性质。结果表明:AuMan5A^(G320D)的最适温度Topt由突变前的65℃提升至70℃,在70℃的半衰期t_(1/2)^(70)由原酶的10 min延长至25 min;AuMan5A^(G320D)的比活性由突变前的351.2 U/mg提高到1 729.1 U/mg,其催化效率(k_(cat)/K_m)是原酶的9.3倍。将Gly^(320)突变为Asp^(320)不仅改善了AuMan5A的温度特性,而且显著提高了该酶的比活性和催化效率。; 董运海胡蝶邬敏辰唐诗涵王春娟李剑芳; 关键词：Β-甘露聚糖酶定点突变温度特性

脂肪酶热稳定性改造研究进展被引量：4: 2014年; 热稳定性改造是脂肪酶酶学性质研究的热点之一,随着技术的发展,越来越多的有效手段被用于脂肪酶热稳定性改造。作者综述了影响脂肪酶热稳定性的主要因素、提高其热稳定性的研究方法以及最新研究成果,为脂肪酶的进一步改造提供依据,并对其他酶的酶学性质改造具有借鉴意义。; 谭中标李剑芳邬敏辰殷欣胡蝶董运海; 关键词：脂肪酶热稳定性随机突变定向进化定点突变

融合β-甘露聚糖酶基因的构建、表达及酶学性质的分析被引量：2: 2016年; 宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)YL-01-78的糖苷水解酶5家族β-甘露聚糖酶(Au Man5A)是一种仅含催化域(CM)的单结构蛋白。为改善其酶学性质,基于理性设计将海栖热胞菌(Thermotoga maritima)MSB8的27家族碳水化合物结合域(CBM27)融合至Au Man5A的C-端,并采用重叠PCR技术构建融合酶基因Auman5A-cbm27。分别将Auman5A-cbm27和Auman5A在毕赤酵母GS115中进行表达,对重组表达产物re Au Man5A-CBM27和re Au Man5A进行纯化和酶学性质测定。结果表明,re Au Man5A-CBM27和re Au Man5A的最适温度均为68℃;两者分别在68和60℃及以下稳定。同时,前者较后者具有更广泛的p H稳定范围。re Au Man5ACBM27对角豆胶的Km值由融合前的1.7 mg/m L降至0.7 mg/m L,表明Au Man5A的底物亲和力得到了提高。; 王春娟李剑芳唐诗涵董运海邬敏辰; 关键词：Β-甘露聚糖酶热稳定性

重组β-甘露聚糖酶制备低聚葡甘露糖工艺条件的优化被引量：7: 2016年; 研究了利用自主构建的重组毕赤酵母菌株GS115/Auman26A所产β-甘露聚糖酶水解魔芋粉制备低聚葡甘露糖的工艺条件。以底物魔芋粉的水解率为指标,通过单因素试验确定酶法制备低聚葡甘露糖的酶解条件如下:加酶量60 U/g,酶解温度40℃,魔芋粉质量浓度30 g/L,酶解时间5 h。魔芋粉水解率和酶解液还原糖质量浓度分别为53.3%和10.45 mg/m L。超滤后的酶解产物经高效液相色谱检测可知组分主要以低聚葡甘露糖为主,其中还原性单糖占9.83%,二糖以上的低聚葡甘露糖占90.17%。; 赵梅王春娟董运海李剑芳邬敏辰; 关键词：魔芋粉超滤

β-甘露聚糖酶AuMan5A/Af酶学性质的改善与其Asp^(320)的相关性分析被引量：1: 2016年; 【目的】为改善宇佐美曲霉5家族β-甘露聚糖酶(AuMan5A)的酶学性质,本实验室前期将AuMan5A底物结合凹槽内一个7肽(^(316)KSPDGGN^(322))组成的loop替换为烟曲霉5家族β-甘露聚糖酶对应的氨基酸片段(PSPNDHF),得到loop替换突变酶AuMan5A/Af。为揭示AuMan5A/Af酶学性质显著改善与其Asp^(320)的相关性,定点突变构建突变体AuMan5A/Af^(D320G)。【方法】采用大引物PCR技术将AuMan5A/Af基因(Auman5A/Af)中编码Asp^(320)的密码子GAC突变为Gly^(320)的GGT,构建出突变体基因Auman5A/Af^(D320G),并在毕赤酵母GS115中进行表达,分析表达产物AuMan5A/Af^(D320G)的酶学性质。【结果】AuMan5A/Af^(D320G)的最适温度T_(opt)为70.0℃,变性温度T_m为71.5℃,介于AuMan5A(T_(opt)=65.0℃,T_m=64.5℃)和AuMan5A/Af(T_(opt)=75.0℃,T_m=76.6℃)之间;在70.0℃的半衰期为40 min,高于AuMan5A的10 min,但较AuMan5A/Af的480 min显著缩短;比活性分别是AuMan5A和AuMan5A/Af的2.7和0.3倍;催化效率(k_(cat)/K_m)分别是AuMan5A和AuMan5A/Af的3.9和0.3倍。【结论】将Asp^(320)突变为Gly^(320)显著影响了AuMan5A/Af的酶学性质,证明了Asp^(320)对AuMan5A/Af温度特性改善、比活性和催化效率显著提高的重要作用。; 李剑芳董运海胡蝶王春娟唐诗涵邬敏辰; 关键词：Β-甘露聚糖酶定点突变酶学性质

不同类型连接肽对β-甘露聚糖酶AuMan5A酶学性质的影响被引量：3: 2017年; 以柔性肽F(GGGGS)3或刚性肽R(EAAAK)3为连接肽,将海栖热胞菌27家族碳水化合物结合域(CBM27)与宇佐美曲霉5家族β-甘露聚糖酶(Au Man5A)的C末端融合,探讨不同类型连接肽对Au Man5A酶学性质的影响,获取具有优良酶学性质的融合酶。采用重叠PCR技术扩增融合酶基因Auman5A-F-cbm^27和Auman5A-R-cbm^27,分别将Auman5A和融合酶基因在毕赤酵母GS115中进行表达,分析表达产物reAuMan5A、reAuMan5A-F-C和reAuMan5A-R-C的酶学性质。结果表明:该3种β-甘露聚糖酶对角豆胶的K_m值分别为1.7、1.9和0.9 mg/mL。3种酶的最适温度T_(opt)分别为70、65和70℃;reAuMan5A-F-C和reAuMan5A-R-C在70℃的半衰期t_(1/2)^(70)分别为36 min和124 min,较reAuMan5A的(t_(1/2)^(70)=9 min)延长了3倍和12.8倍。reAuMan5A-R-C具有底物亲和力强、热稳定性高和pH稳定范围广等特点,在食品、饲料、医药和能源等领域有着巨大的应用潜力。; 王春娟唐诗涵邬敏辰董运海杭宜岭李剑芳; 关键词：连接肽 Β-甘露聚糖酶热稳定性

杂合β-甘露聚糖酶AuMan5A^(loop)的H321对其酶学性质的影响: 2017年; 目的:将loop置换杂合β-甘露聚糖酶AuMan5A^(loop)的H321突变回野生型酶AuMan5A对应的Gly,以分析杂合酶的酶学性质与H321的相关性。方法:采用大引物PCR技术将AuMan5A^(loop)基因(Auman5Aloop)编码H321的密码子CAC突变为Gly的GGT,构建突变酶基因Auman5A^(loop/H321G);借助表达质粒pPICZαA将该突变酶基因在Pichia pastoris GS115中实施表达,并分析重组表达产物AuMan5A^(loop) H321G的酶学性质。结果:AuMan5A^(loop/H321G)置换前后的最适温度T_(opt)均为75℃,高于AuMan5A的65℃;AuMan5A^(loop/H321G)在70℃的半衰期t_(1/2)^(70)为300 min,介于AuMan5A(10 min)和AuMan5A^(loop)(480 min)之间;AuMan5A^(loop/H321G)比活性分别为AuMan5A和AuMan5A^(loop)的12.8和1.43倍;催化效率k_(cat)/K_m为后两者的14.1和1.12倍。结论:通过H321G置换及对3种酶的温度特性、比活性和催化效率的测定及比较,证实了H321对AuMan5A^(loop)的酶学性质有一定的影响。; 李雪晴袁风娇程建青董运海李剑芳邬敏辰; 关键词：Β-甘露聚糖酶杂合酶定点突变突变酶酶学性质

置换β-甘露聚糖酶底物结合槽内环结构序列改善其酶学特性: 2015年; 位于酶分子活性位点（又称活性中心）附近的环结构对酶促反应特性具有重要影响.本实验室先前在宇佐美曲霉Aspergillus usamii中发现了一种新的5家族β-甘露聚糖酶Au Man5A.通过同源建模、分子对接及多序列比对,发现位于Au Man5A底物结合凹槽侧壁的一段环结构可能对酶的功能有影响.为证明该假说,本研究采用Au Man5A为母本,利用PCR技术将其底物结合槽内的7肽环结构316KSPDGGN322替换成与两种木霉属β-甘露聚糖酶对应的8肽片段AQSNSDPY,构建了杂合酶基因Auman5ALoop,并在毕赤酵母GS115中进行表达,经纯化获得了杂合β-甘露聚糖酶Au Man5ALoop.酶学特性分析结果显示,与原酶Au Man5A比较,Au Man5ALoop的最适反应p H由3.5~4.0扩宽至3.5~5.5;最适反应温度由65℃提高至70℃;以角豆胶为底物,测得Au Man5ALoop的比活性由351.2 U/mg提高至2 089.2 U/mg.利用双倒数作图法测得动力学常数揭示,Au Man5ALoop的Km值较Au Man5A降低了36%,而kcat值是Au Man5A的6.8倍;同时,Au Man5ALoop的催化效率（kcat/Km）提高了10.7倍.我们的结果说明,通过替换Au Man5A底物结合槽内环结构,可明显改进其酶学特性.我们的结果还提示,活性位点附近的环结构对β-甘露聚糖酶的酶学特性具有重要影响.; 董运海胡蝶王春娟李剑芳邬敏辰; 关键词：酶学特性

耐热β-甘露聚糖酶基因的克隆与表达及酶学性质被引量：9: 2014年; 基于生物信息学和基因组学分析的结果,采用RT-PCR技术从宇佐美曲霉（AspergiLLus usamii）E001中克隆出一种糖苷水解酶（GH） 26家族β-甘露聚糖酶（AuMan26A）成熟肽编码基因（A uman26A）,成功实现其在毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中的异源表达.重组β-甘露聚糖酶（reAuMan26A）的发酵上清液对角豆胶的酶活性为281.9 U/mL,纯化后比酶活为2281.7 U/mg.其最造反应温度Topt为40℃;在80℃处理60 min后残留酶活性为60％;90℃时的半衰期T1/290为10 min,处理60 min后残留酶活性仍为33％;其最适pH为5.5,在pH 5.0～7.0的范围内较稳定;Fe^2＋和Fe^3＋对其有明显的抑制作用,其它所测金属离子和EDTA对其没有明显的影响;所测酶的最适底物为角豆胶,其次是魔芋粉和瓜尔豆胶,其对角豆胶的Km和Vmax值分别为15.25 mg/mL和7 841.9 U/mg.reAuMan26A良好的热稳定性使其在食品、饲料和纺织等工业具有广阔的应用前景.; 赵梅魏喜换王春娟董运海李剑芳邬敏辰; 关键词：Β-甘露聚糖酶耐热性基因克隆和表达酶学性质

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