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β-甘露聚糖酶AuMan5Aloop/H321G在乳酸克鲁维酵母中的高效表达被引量：2: 2019年; 为制备食品级β-甘露聚糖酶,将来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)的糖苷水解酶5家族β-甘露聚糖酶突变体基因(AuMan5Aloop/H321G)克隆至表达质粒pKLAC1信号肽α-MF下游,构建重组表达质粒pKLAC1-AuMan5Aloop/H321G,并电转化乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)GG799。采用半乳糖诱导表达和酶活性分析获得了高水平表达的重组β-甘露聚糖酶突变酶(reAuMan5Aloop/H321G)的转化子GG799/AuMan5Aloop/H321G,其产酶活力为54.9 U/mL。SDS-PAGE分析显示,reAuMan5Aloop/H321G的表观相对分子质量约为55 000。经YPG培养基初始pH、摇瓶装液量以及诱导剂的种类、初始质量浓度和添加方式的初步优化,GG799/AuMan5Aloop/H321G所产酶活力较工艺优化前提高了254.6%,从而实现了reAuMan5Aloop/H321G在乳酸克鲁维酵母中的高效表达。; 唐诗涵李雪晴袁风娇李剑芳邬敏辰; 关键词：Β-甘露聚糖酶乳酸克鲁维酵母诱导剂发酵工艺

融合β-甘露聚糖酶基因的构建、表达及酶学性质的分析被引量：2: 2016年; 宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)YL-01-78的糖苷水解酶5家族β-甘露聚糖酶(Au Man5A)是一种仅含催化域(CM)的单结构蛋白。为改善其酶学性质,基于理性设计将海栖热胞菌(Thermotoga maritima)MSB8的27家族碳水化合物结合域(CBM27)融合至Au Man5A的C-端,并采用重叠PCR技术构建融合酶基因Auman5A-cbm27。分别将Auman5A-cbm27和Auman5A在毕赤酵母GS115中进行表达,对重组表达产物re Au Man5A-CBM27和re Au Man5A进行纯化和酶学性质测定。结果表明,re Au Man5A-CBM27和re Au Man5A的最适温度均为68℃;两者分别在68和60℃及以下稳定。同时,前者较后者具有更广泛的p H稳定范围。re Au Man5ACBM27对角豆胶的Km值由融合前的1.7 mg/m L降至0.7 mg/m L,表明Au Man5A的底物亲和力得到了提高。; 王春娟李剑芳唐诗涵董运海邬敏辰; 关键词：Β-甘露聚糖酶热稳定性

定点突变改善β-甘露聚糖酶AuMan5A的酶学性质被引量：1: 2017年; 基于糖苷水解酶5家族(GHF5)β-甘露聚糖酶一级、三维结构的比对和分析,对宇佐美曲霉GHF5β-甘露聚糖酶AuMan5A的关键位点氨基酸实施定点突变以获得酶学性质优良的突变酶AuMan5A^(G320D)。采用大引物PCR技术将AuMan5A基因(Auman5A)中编码Gly^(320)的密码子GGT突变为Asp^(320)的GAC,构建出突变酶基因Auman5A^(G320D)。分别将Auman5A和Auman5A^(G320D)在毕赤酵母GS115中进行了表达,分析了表达产物AuMan5A和AuMan5A^(G320D)的酶学性质。结果表明:AuMan5A^(G320D)的最适温度Topt由突变前的65℃提升至70℃,在70℃的半衰期t_(1/2)^(70)由原酶的10 min延长至25 min;AuMan5A^(G320D)的比活性由突变前的351.2 U/mg提高到1 729.1 U/mg,其催化效率(k_(cat)/K_m)是原酶的9.3倍。将Gly^(320)突变为Asp^(320)不仅改善了AuMan5A的温度特性,而且显著提高了该酶的比活性和催化效率。; 董运海胡蝶邬敏辰唐诗涵王春娟李剑芳; 关键词：Β-甘露聚糖酶定点突变温度特性

β-甘露聚糖酶AuMan5A/Af酶学性质的改善与其Asp^(320)的相关性分析被引量：1: 2016年; 【目的】为改善宇佐美曲霉5家族β-甘露聚糖酶(AuMan5A)的酶学性质,本实验室前期将AuMan5A底物结合凹槽内一个7肽(^(316)KSPDGGN^(322))组成的loop替换为烟曲霉5家族β-甘露聚糖酶对应的氨基酸片段(PSPNDHF),得到loop替换突变酶AuMan5A/Af。为揭示AuMan5A/Af酶学性质显著改善与其Asp^(320)的相关性,定点突变构建突变体AuMan5A/Af^(D320G)。【方法】采用大引物PCR技术将AuMan5A/Af基因(Auman5A/Af)中编码Asp^(320)的密码子GAC突变为Gly^(320)的GGT,构建出突变体基因Auman5A/Af^(D320G),并在毕赤酵母GS115中进行表达,分析表达产物AuMan5A/Af^(D320G)的酶学性质。【结果】AuMan5A/Af^(D320G)的最适温度T_(opt)为70.0℃,变性温度T_m为71.5℃,介于AuMan5A(T_(opt)=65.0℃,T_m=64.5℃)和AuMan5A/Af(T_(opt)=75.0℃,T_m=76.6℃)之间;在70.0℃的半衰期为40 min,高于AuMan5A的10 min,但较AuMan5A/Af的480 min显著缩短;比活性分别是AuMan5A和AuMan5A/Af的2.7和0.3倍;催化效率(k_(cat)/K_m)分别是AuMan5A和AuMan5A/Af的3.9和0.3倍。【结论】将Asp^(320)突变为Gly^(320)显著影响了AuMan5A/Af的酶学性质,证明了Asp^(320)对AuMan5A/Af温度特性改善、比活性和催化效率显著提高的重要作用。; 李剑芳董运海胡蝶王春娟唐诗涵邬敏辰; 关键词：Β-甘露聚糖酶定点突变酶学性质

不同类型连接肽对β-甘露聚糖酶AuMan5A酶学性质的影响被引量：3: 2017年; 以柔性肽F(GGGGS)3或刚性肽R(EAAAK)3为连接肽,将海栖热胞菌27家族碳水化合物结合域(CBM27)与宇佐美曲霉5家族β-甘露聚糖酶(Au Man5A)的C末端融合,探讨不同类型连接肽对Au Man5A酶学性质的影响,获取具有优良酶学性质的融合酶。采用重叠PCR技术扩增融合酶基因Auman5A-F-cbm^27和Auman5A-R-cbm^27,分别将Auman5A和融合酶基因在毕赤酵母GS115中进行表达,分析表达产物reAuMan5A、reAuMan5A-F-C和reAuMan5A-R-C的酶学性质。结果表明:该3种β-甘露聚糖酶对角豆胶的K_m值分别为1.7、1.9和0.9 mg/mL。3种酶的最适温度T_(opt)分别为70、65和70℃;reAuMan5A-F-C和reAuMan5A-R-C在70℃的半衰期t_(1/2)^(70)分别为36 min和124 min,较reAuMan5A的(t_(1/2)^(70)=9 min)延长了3倍和12.8倍。reAuMan5A-R-C具有底物亲和力强、热稳定性高和pH稳定范围广等特点,在食品、饲料、医药和能源等领域有着巨大的应用潜力。; 王春娟唐诗涵邬敏辰董运海杭宜岭李剑芳; 关键词：连接肽 Β-甘露聚糖酶热稳定性

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唐诗涵