胡蝶
- 作品数：14 被引量：29H指数：3
- 供职机构：江南大学生物工程学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金江苏省研究生培养创新工程项目江苏省普通高校研究生科研创新计划项目更多>>
- 相关领域：生物学轻工技术与工程化学工程理学更多>>
- 新型卤代醇脱卤酶基因的克隆、序列分析及表达被引量：1
- 2015年
- 卤代醇脱卤酶可以催化合成具有光学纯的环氧化物及β-取代醇等高价值手性药物中间体。作者所在实验室利用宏基因组技术从无锡新区工业集中地污染土壤中筛选了一段编码基因Y,经测序知其片段包含有765 bp的核苷酸,编码254个氨基酸。经Blast软件分析,其氨基酸序列与来自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的卤代醇脱卤酶Hhe C同源性为81%,且含有卤代醇脱卤酶类的保守催化三联体Ser132-Thr145-Arg149。推测其属于卤代醇脱卤酶Hhe C类,命名为Sy Hhe C。根据大肠杆菌Escherichia coli BL21的密码子偏爱性,对基因Y进行密码子优化和人工合成,命名为Syhhe C,构建重组表达质粒p ET28a-Syhhe C,转化感受态E.coli BL21,表达产物经镍柱亲和层析后获得电泳纯的重组卤代醇脱卤酶re Sy Hhe C。SDS-PAGE分析,re Sy Hhe C的相对分子质量为34 000。以2-溴-1-(4-硝基苯基)-乙醇为底物,re Sy Hhe C催化底物产生2-(4-硝基苯基)环氧乙烷的比活性为5.2 U/mg。
- 冯峰胡蝶余涛曾妍邬敏辰
- 关键词：宏基因组技术密码子优化
- Y13F定点突变改良米曲霉中温木聚糖酶的耐热性被引量：2
- 2016年
- 为改良米曲霉(Aspergillus oryzae)糖苷水解酶11家族木聚糖酶AoXyn11A的耐热性,将其Tyr^(13)(Y13)置换为Phe(F)。基于AoXyn11A与同一家族7种耐热木聚糖酶一级结构的多序列同源比对及其三维结构的同源建模和分子动力学模拟,设计了一种突变酶AoXyn11A^(Y13F);以重组质粒p PIC9K-Aoxyn11A为模板,采用PCR技术将AoXyn11A基因(Aoxyn11A)中编码Y13的密码子TAC突变为F的TTC,构建了一种突变酶基因(Aoxyn11A^(Y13F));分别将Aoxyn11A和Aoxyn11A^(Y13F)在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中实施了表达,并对重组表达产物AoXyn11A和AoXyn11A^(Y13F)的耐热性进行了分析。结果表明:突变酶的最适温度T_(opt)由突变前的50℃提高到55℃;AoXyn11A^(Y13F)在50℃的半衰期t_(1/2)^(50)为95 min,较AoXyn11A(t_(1/2)^(50)=6 min)延长了约15倍。由此经Y13F定点突变显著改良了野生型木聚糖酶的耐热性。
- 吴芹胡蝶李雪晴袁风娇李剑芳邬敏辰
- 关键词：定点突变疏水相互作用
- 重组葡萄糖脱氢酶的酶学性质及其偶联辅酶再生被引量：7
- 2014年
- 为解决生物催化氧化还原反应中辅酶循环问题,人工合成密码子优化后的嗜酸热源体Thermoplasma acidophilum葡萄糖脱氢酶基因Sygdh,于E.coli BL21 （DE3）中表达,粗酶液经镍柱亲和层析获得纯化的重组葡萄糖脱氢酶SyGDH.SDS-PAGE显示相对分子质量为41.0 kDa.酶学性质分析表明：该酶的最适pH值为7.5,在pH 6.0～8.0稳定;最适反应温度为40℃,在55℃以下稳定;最适条件下其比活性达4.5 U/mg; Zn2＋对其有明显激活作用;该酶对NADP＋的亲和力大于NAD＋且对大多数有机溶剂有良好的耐受性;对D-葡萄糖的Km和Vmax值分别为28.2 mmol/L和6.5 U/mg.在葡萄糖脱氢酶与羰基还原酶偶联构建的NADPH辅酶循环体系中,以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物,羰基还原酶催化产物4-氯-3-羟基丁酸乙酯的产率为99.0％,是未添加葡萄糖脱氢酶时产物产率的3.11倍,表明重组SyGDH具有为生物催化氧化还原反应提供辅酶NADPH再生的能力.
- 余涛胡蝶邬敏辰汪俊卿冯峰顾颖
- 关键词：葡萄糖脱氢酶酶学性质羰基还原酶生物催化
- N-端置换提高木聚糖酶AoXyn11A的耐热性被引量：1
- 2017年
- 为提高米曲霉(Aspergillus oryzae)糖苷水解酶家族(GHF)11木聚糖酶AoXyn11A的耐热性,将其N-端置换为来源于嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的同一家族耐热木聚糖酶pXYL11的对应区域。基于木聚糖酶耐热性的理性设计,采用大引物PCR技术将AoXyn11A基因(Aoxyn11A)的5′-端DNA片段置换为pXYL11人工合成基因(xyn11PM)的对应片段,构建出杂合木聚糖酶ATX11A基因(ATx11A)。分别将Aoxyn11A和ATx11A在毕赤酵母GS115中进行了表达,并分析了重组表达产物AoXyn11A和ATX11A的温度特性。结果表明:ATX11A的最适温度T_(opt)由AoXyn11A的50℃提升至65℃,在60℃的半衰期t_(1/2)^(60)为55 min,较AoXyn11A延长了41.3倍;ATX11A在55℃处理3 h保留60%以上的酶活性,而AoXyn11A处理15 min酶活性完全丧失。本研究通过N-端置换显著改善了AoXyn11A的温度特性。
- 何瑶吴芹殷欣胡蝶邬敏辰
- 关键词：木聚糖酶耐热性分子动力学模拟
- 宇佐美曲霉环氧化物水解酶基因的克隆与生物信息学分析被引量：1
- 2013年
- 环氧化物水解酶(Epoxide hydrolase,EH)是酶法拆分消旋体环氧化物,制备光学活性环氧化物和邻二醇的重要酶之一。通过RT-PCR和新构建的THSO-PCR侧翼未知DNA序列扩增技术,克隆了一种来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的EH基因,命名为Aueh2(GenBank No.KF061095),并对该基因进行了相关生物信息学分析。Aueh2的DNA序列长度为2 481 bp,其中包含了5′端和3′端侧翼调控序列,6个内含子序列和编码cDNA序列。开放阅读框序列长度为1 188 bp,编码395个氨基酸,对应的蛋白质命名为AuEH2;该蛋白质为无信号肽的亲水蛋白质,其理论相对分子质量44.6 kD;其三维结构包含EH典型的"α/β"核心催化结构域和"帽子"结构域,活性中心由催化三联体Asp191、His369和Glu343组成。本课题研究成果为深入研究AuEH2及其应用奠定了基础。
- 胡蝶朱利娟邬敏辰汪俊卿唐存多冯峰余涛
- 关键词：宇佐美曲霉基因克隆生物信息学分析
- 定点饱和突变改善米曲霉木聚糖酶的温度特性被引量：3
- 2019年
- 为改善米曲霉木聚糖酶AoXyn11A的温度特性,基于其三维结构的同源建模和分子动力学模拟,随机替换最高B-factor值位点处的Gly21。以重组表达质粒pET-28a-Aoxyn11A为模板,采用全质粒两步PCR技术对AoXyn11A基因(Aoxyn11A)中编码Gly21的密码子实施饱和突变,将pET-28a-Aoxyn11A各突变体转化E.coli BL21(DE3),构建了突变转化子文库。以酶的热稳定性为指标,从文库中筛选出最优突变转化子(E.coli/Aoxyn11AG21I)。DNA测序结果显示,E.coli/Aoxyn11AG21I表达一种由Ile21替换了Gly21的突变酶AoXyn11AG21I。温度特性分析表明:突变酶的最适温度由突变前的55℃提高至65℃;AoXyn11AG21I在55℃及以下稳定,较AoXyn11A提高了7℃。另外,AoXyn11A突变前后的pH特性改变不大。
- 吴芹臧嘉胡蝶王瑞邬敏辰
- 关键词：木聚糖酶温度特性分子动力学模拟
- 定点突变改善β-甘露聚糖酶AuMan5A的酶学性质被引量：1
- 2017年
- 基于糖苷水解酶5家族(GHF5)β-甘露聚糖酶一级、三维结构的比对和分析,对宇佐美曲霉GHF5β-甘露聚糖酶AuMan5A的关键位点氨基酸实施定点突变以获得酶学性质优良的突变酶AuMan5A^(G320D)。采用大引物PCR技术将AuMan5A基因(Auman5A)中编码Gly^(320)的密码子GGT突变为Asp^(320)的GAC,构建出突变酶基因Auman5A^(G320D)。分别将Auman5A和Auman5A^(G320D)在毕赤酵母GS115中进行了表达,分析了表达产物AuMan5A和AuMan5A^(G320D)的酶学性质。结果表明:AuMan5A^(G320D)的最适温度Topt由突变前的65℃提升至70℃,在70℃的半衰期t_(1/2)^(70)由原酶的10 min延长至25 min;AuMan5A^(G320D)的比活性由突变前的351.2 U/mg提高到1 729.1 U/mg,其催化效率(k_(cat)/K_m)是原酶的9.3倍。将Gly^(320)突变为Asp^(320)不仅改善了AuMan5A的温度特性,而且显著提高了该酶的比活性和催化效率。
- 董运海胡蝶邬敏辰唐诗涵王春娟李剑芳
- 关键词：Β-甘露聚糖酶定点突变温度特性
- 脂肪酶热稳定性改造研究进展被引量：4
- 2014年
- 热稳定性改造是脂肪酶酶学性质研究的热点之一,随着技术的发展,越来越多的有效手段被用于脂肪酶热稳定性改造。作者综述了影响脂肪酶热稳定性的主要因素、提高其热稳定性的研究方法以及最新研究成果,为脂肪酶的进一步改造提供依据,并对其他酶的酶学性质改造具有借鉴意义。
- 谭中标李剑芳邬敏辰殷欣胡蝶董运海
- 关键词：脂肪酶热稳定性随机突变定向进化定点突变
- β-甘露聚糖酶AuMan5A/Af酶学性质的改善与其Asp^(320)的相关性分析被引量：1
- 2016年
- 【目的】为改善宇佐美曲霉5家族β-甘露聚糖酶(AuMan5A)的酶学性质,本实验室前期将AuMan5A底物结合凹槽内一个7肽(^(316)KSPDGGN^(322))组成的loop替换为烟曲霉5家族β-甘露聚糖酶对应的氨基酸片段(PSPNDHF),得到loop替换突变酶AuMan5A/Af。为揭示AuMan5A/Af酶学性质显著改善与其Asp^(320)的相关性,定点突变构建突变体AuMan5A/Af^(D320G)。【方法】采用大引物PCR技术将AuMan5A/Af基因(Auman5A/Af)中编码Asp^(320)的密码子GAC突变为Gly^(320)的GGT,构建出突变体基因Auman5A/Af^(D320G),并在毕赤酵母GS115中进行表达,分析表达产物AuMan5A/Af^(D320G)的酶学性质。【结果】AuMan5A/Af^(D320G)的最适温度T_(opt)为70.0℃,变性温度T_m为71.5℃,介于AuMan5A(T_(opt)=65.0℃,T_m=64.5℃)和AuMan5A/Af(T_(opt)=75.0℃,T_m=76.6℃)之间;在70.0℃的半衰期为40 min,高于AuMan5A的10 min,但较AuMan5A/Af的480 min显著缩短;比活性分别是AuMan5A和AuMan5A/Af的2.7和0.3倍;催化效率(k_(cat)/K_m)分别是AuMan5A和AuMan5A/Af的3.9和0.3倍。【结论】将Asp^(320)突变为Gly^(320)显著影响了AuMan5A/Af的酶学性质,证明了Asp^(320)对AuMan5A/Af温度特性改善、比活性和催化效率显著提高的重要作用。
- 李剑芳董运海胡蝶王春娟唐诗涵邬敏辰
- 关键词：Β-甘露聚糖酶定点突变酶学性质
- 内切葡聚糖酶与木聚糖酶在毕赤酵母中的共分泌表达被引量：4
- 2015年
- 为实现内切葡聚糖酶和木聚糖酶在毕赤酵母中的共分泌表达,进而降低酶制剂的生产成本,构建含木聚糖酶基因的重组表达载体pPICZαA-Aoxyn11A,经SacI线性化后,电转化至含内切葡聚糖酶基因Aucel12A的重组毕赤酵母GSC7中,获得双重重组毕赤酵母GSCX8。经甲醇诱导表达后,GSCX8发酵上清液中内切葡聚糖酶和木聚糖酶的活性分别为47.77IU/mL和192.71IU/mL,为单独表达菌株GSC7和GSX5的85%和80%。酶学性质分析显示,内切葡聚糖酶的最适pH为4.0,在pH3.0-8.5稳定;最适温度为50℃,在60℃以下稳定。木聚糖酶的最适pH为5.5,在pH3.0-10.0稳定;最适温度为55℃,在50℃以下稳定。GSCX8遗传稳定性测试结果表明,内切葡聚糖酶和木聚糖酶在毕赤酵母中实现了稳定的共表达。
- 刘高磊胡蝶邬敏辰殷欣汪俊卿
- 关键词：内切葡聚糖酶木聚糖酶毕赤酵母
