杜桂鑫
- 作品数：36 被引量：84H指数：5
- 供职机构：军事医学科学院微生物流行病研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 丙型肝炎病毒准种在NS2区的变异状况初探被引量：1
- 2001年
- 探讨HCV准种在NS2区的基因结构特征及变异状况。利用逆转录 巢式PCR从 1份HCV慢性携带者的阳性血清及 1份丙肝患者的血清中获得HCVNS2全长cDNA ,将其克隆于T载体 ,各随机挑取 5个阳性克隆进行序列测定。结果显示克隆到HCVNS2全长基因 ,所测克隆在核苷酸水平和氨基酸水平互不相同。该慢性携带者HCVNS2区序列以完整读码框架 (ORF)为主 ,一个于HCV多聚蛋白第 835位氨基酸的位置出现终止信号 ,而该丙型肝炎患者以NS2N端发现终止信号的序列为主 ,其中三个于第 835位氨基酸的位置出现终止信号 ,一个于第 887位氨基酸的位置出现终止信号 ,仅一个克隆的序列为完整ORF。对ORF完整的序列进行比较 ,发现丙型肝炎患者氨基酸变异主要集中于N端 ,蛋白二级结构模拟显示丙肝患者NS2与慢性携带者的优势二级结构类似。研究表明从我们选择的两例感染者的HCVNS2序列看 ,不同临床类型的HCV病人体内的HCV准种在NS2区存在差异 ,这种差异可能与病毒存在于机体的状态有一定的一致性。
- 冷彦陈秀珠杜勇毛春生杜桂鑫王海涛
- 关键词：丙型肝炎病毒准种
- 人源抗HAV噬菌体抗体的筛选及基因序列分析被引量：3
- 1999年
- 目的获得人源性甲型肝炎病毒（ＨＡＶ）抗体。方法应用抗体捕获的ＨＡＶ，从本实验室构建的噬菌体抗体组合文库中筛选与ＨＡＶ病毒有结台活性的人源噬菌体抗体（Ｆａｂ段），用夹心ＥＬＩＳＡ和竞争抑制实验测定其活性及特异性。结果筛选出与ＨＡＶ病毒有结台活性和特异性的人源抗体。序列分析表明重链基因为ＩｇＧＩ亚类，可变区属ＶＨＩ亚群，是ＤＰ８８、Ｄ３—３和ＪＨＳ胚系基因片段的重排产物；轻链基因属ＶＸｌｌｌ亚群，是ＤＰＸ２２和Ｊｋ４胚系基因的重排产物。结论应用抗体捕获抗原的方法，能从该抗体库筛选出ＨＡＶ抗体，也说明该抗体库的构建是成功的。
- 于长明杜桂鑫毛春生宋宏彬徐志凯王海涛
- 关键词：甲型肝炎病毒抗体噬菌体HAV
- 抗甲型肝炎病毒抗体Fab在大肠杆菌中的表达被引量：3
- 2002年
- 目的在大肠杆菌中高效表达人源抗HAV抗体Fab，为进一步研究该抗体的功能奠定基础。方法依次将抗HAV抗体的Fd及轻链基因克隆到表达载体pASK84的不同信号序列下，构建成Fab表达质粒，在大肠杆菌JM83中进行表达，并对表达产物进行复性。用SDS-PAGE、western blot和ELISA法检测Fab的表达及其与甲肝病毒抗原的结合活性。结果 构建了抗HAV Fab的重组表达质粒p84Fab，在大肠杆菌JM83中获得表达，表达的Fab占全菌的25%，主要以包涵体形式存在，复性后具有抗原结合活性；培养基、菌体可溶性蛋白部分也能检测到有抗原结合活性的Fab。 结论抗HAV抗体Fab在大肠杆菌中得到了表达，并具有良好的抗原结合活性。
- 于长明宋宏彬杜桂鑫徐静徐志凯王海涛
- 关键词：甲型肝炎病毒FAB基因表达大肠杆菌
- 噬菌体抗体库技术的应用现状
- 1999年
- 噬菌体抗体库是抗体组合文库技术和噬菌体表面展示技术相结合形成的一项新技术,近年来已经逐渐成为基因工程抗体研究的关键技术,被广泛应用于生命科学的许多方面。本文着重对该技术在医学微生物学、自身免疫性疾病、肿瘤研究以及疾病诊治等方面的应用情况进行综述,同时也对其应用前景进行预测。
- 杜桂鑫
- 关键词：噬菌体抗体库自身免疫病
- 人噬菌体抗体库的构建和甲肝抗体的筛选被引量：12
- 2000年
- 目的 构建人噬菌体抗体组合文库,筛选人单克隆抗体。方法 用RTPCR扩增人全套抗体基因片段,克隆于pComb3载体,电转化E.coli形成噬菌体抗体库;以固相化抗原淘筛抗体库,ELISA鉴定噬菌体抗体。结果 17对免疫球蛋白引物全部能够扩增出目的片段;经数次电转化构建了库容为693×107的抗体库,滴度为8×1014PFU/ml,Fab基因重组率为40%。以单抗捕获的甲肝抗原淘洗3轮,出现特异性富集;阳性克隆经直接ELISA和竞争抑制性ELISA实验证实具有良好的抗甲肝抗原特异性,无交叉反应性。结论 成功构建了抗体组合文库,从中获得抗甲肝抗原的特异性人抗体。
- 杜桂鑫于长明毛春生王海涛
- 关键词：噬菌体抗体库
- 骨形成蛋白7真核表达质粒的构建及在骨髓间充质干细胞中的表达被引量：9
- 2003年
- 目的 构建骨形成蛋白 7(hBMP7)基因真核表达质粒 ,并使其在骨髓间充质干细胞中表达。 方法 采用PCR技术扩增BMP7基因 ,将其插入真核表达载体pcDNA3 1中 ,利用梯度离心法分离培养骨髓间充质干细胞 (MSCs) ,然后用构建的BMP7表达质粒转染MSCs,使其得到表达。结果 经过PCR及酶切鉴定证明获得了BMP7真核表达质粒pcDNA BMP7,通过反转录PCR和免疫组化鉴定证明BMP7在转染后的骨髓间充质干细胞中得到了表达。 结论 BMP7真核表达质粒的构建和在骨髓间充质干细胞中的表达 ,为BMP7基因治疗的研究奠定了坚实的基础 ,同时也为组织工程成骨和成软骨的研究提供了改良的种子细胞。
- 侯树勋孙大铭杜桂鑫童贻刚付小兵
- 关键词：骨形成蛋白7真核表达质粒骨髓间充质干细胞基因转染
- 丙型肝炎病毒NS5ab区的B细胞模拟表位的确认被引量：3
- 2003年
- 目的 用噬菌体展示随机肽库研究丙型肝炎病毒 (HCV)NS5ab区的B细胞表位。方法 在原核系统中表达了HCVNS5ab重组蛋白 ,亲和层析纯化血清中抗HCVNS5ab的特异多抗 ,用此多抗来筛选噬菌体递呈随机 12肽库 ,获得HCVNS5ab区的B细胞表位。结果 成功地表达了HCVNS5ab重组蛋白 ,用此蛋白检验了 130份HCV阳性血清 ,阳性率为 36 %。在筛选的噬菌体展示随机肽库后 ,挑取 13个阳性克隆测序 ,有 9个序列不同 ,最终通过噬菌体表位表达的方法确认了 3个表位。
- 侯利华杜桂鑫王海涛
- 关键词：丙型肝炎病毒
- 丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶特异性结合肽的筛选和鉴定被引量：4
- 2002年
- 丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶在病毒复制和包装中的重要作用使其成为特异性抗病毒药物研究的首选靶标。根据丝氨酸蛋白酶晶体结构特点 ,用柔性连接子连接NS3丝氨酸蛋白酶结构域和NS4A的核心序列 ,构建成单链丝氨酸蛋白酶基因并且在大肠杆菌中获得高水平的可溶性表达 ,纯化后的目的蛋白能够切割重组蛋白底物NS5ab。随后 ,以单链丝氨酸蛋白酶为靶分子对噬菌体展示的随机十二肽库进行了三轮淘筛 ,挑选的 44个克隆中有 3 7个克隆能够特异性地结合丝氨酸蛋白酶 ,并且这种结合作用为竞争性ELISA试验结果所支持。对 1 3个克隆进行序列测定 ,得到 6种序列 ,它们在氨基酸组成上存在明显偏性 ,富含组氨酸和色氨酸 ,缺乏酸性氨基酸 ;
- 杜桂鑫侯利华陈万荣张永国王海涛
- 关键词：丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶特异性结合肽噬菌体展示肽库
- 表位水平研究病毒流行病学的方法探讨被引量：2
- 2002年
- 应用噬菌体随机展示肽库和硫氧还蛋白表面展示技术 ,建立了在表位水平研究病毒流行病学的方法 ,并以丙型肝炎病毒核心区蛋白做了初步验证 。
- 来大志杜勇杜桂鑫陈薇王海涛
- 关键词：表位流行病学肽库噬菌体硫氧还蛋白HCV
- 人源抗甲型肝炎病毒Fab在大肠杆菌中的表达及复性
- 2002年
- 于长明宋宏彬杜桂鑫徐静徐志凯王海涛
- 关键词：噬菌体甲肝疫苗大肠杆菌
