孙海凤
- 作品数：10 被引量：40H指数：3
- 供职机构：南京农业大学更多>>
- 发文基金：国家生猪现代产业技术体系建设项目国家自然科学基金国家公益性行业科研专项更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3蛋白单克隆抗体制备及抗原表位鉴定
- 2023年
- 旨在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3蛋白单克隆抗体及解析其抗原表位。本研究构建了PRRSV类NADC30毒株FJ1402的GP3大肠杆菌表达质粒,制备获得重组GP3蛋白。经过免疫BALB/c小鼠和间接ELISA方法筛选获得阳性杂交瘤细胞。利用间接免疫荧光试验和蛋白印迹鉴定单克隆抗体特异性。通过构建GP3蛋白基因截短体和合成多肽ELISA鉴定单克隆抗体识别的表位区域。结果显示,成功筛选了7株稳定分泌GP3蛋白抗体的杂交瘤细胞株,7株单克隆抗体均可与PRRSV FJ1402产生特异性反应。鉴定出GP3蛋白4个抗原表位,分别为^(55)PLCPTRQAAAEILE^(68)、^(69)PGKSFWCRI^(77)、^(78)GHDRCSESDH^(87)和^(88)DELGFMVPPGLSS^(100)。2E12单抗与FJ1402、BB0907和S1三个谱系毒株均可发生IFA和Western blot特异反应,4H9、9F3和6B3单抗只与FJ1402毒株反应,而不与BB0907和S1毒株反应。本研究研制成功7株GP3蛋白单克隆抗体,并鉴定出4个GP3蛋白抗原表位,为PRRSV检测和GP3蛋白功能研究提供了重要工具。
- 袁丽孙杨杨张路捷张杰孙海凤白娟姜平
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3蛋白单克隆抗体抗原表位
- 猪源伪狂犬病病毒gB蛋白抗体阻断ELISA的建立与应用被引量：4
- 2018年
- 利用伪狂犬病病毒（PRV）ZJ01毒株重组gB蛋白及其对应的HRP标记的单克隆抗体,旨在建立一种检测伪狂犬病病毒gB抗体的阻断ELISA。对ELISA反应条件进行了优化,具体为：包被抗原的质量浓度为0.5 g/mL;待检血清的稀释比例为1∶1,孵育条件是37℃作用1 h;酶标单抗的稀释度为1∶15 000,作用时间为37℃0.5 h。ELISA结果的判定标准为：血清样品阻断率PI≥28.67%时判为阳性;PI≤18.27%时判为阴性;18.27%〈PI〈28.67%时判为可疑。该ELISA能特异性地识别PRV阳性血清,而与PRRSV、PCV2、CSFV和FMDV阳性血清无交叉反应性。ELISA的重复性试验表明,批间和批内的变异系数均小于10%。比较试验结果表明,该ELISA的相对敏感性和特异性分别为80.9%和96.4%,与IDEXX PRV gB ELISA试剂盒的符合率为85.1%。用建立的此ELISA对田间采集的535份猪临床血清样品进行了检测,结果显示,PRV抗体阳性率达61.87%。综上所述,本试验建立的猪源伪狂犬病病毒gB蛋白抗体阻断ELISA具有特异、简单、快速的优点,为建立标准化的检测试剂盒奠定了基础。
- 孙海凤徐旋董静孙涛白娟姜平
- 关键词：伪狂犬病病毒阻断ELISA
- 伪狂犬病毒流行毒株的抗原性和血清中和特性分析被引量：26
- 2014年
- 2011年以来,我国多个省份伪狂犬病免疫猪群相继暴发伪狂犬病疫情.为了探明伪狂犬病毒（PRV）流行毒株是否存在抗原变异,本研究从3个规模猪场3种PRV商品疫苗免疫的健康猪群中采集30份血清,经检测PRVgBELISA抗体均为阳性,gE ELISA抗体均为阴性.采用PRV新流行毒株ZJ-01株和传统的LA毒株分别进行血清中和抗体测定,结果显示,3个毒株活疫苗免疫血清与ZJ-01株中和抗体效价明显低于其与LA株中和抗体效价.同时,ZJ-01株抗血清与ZJ-01株和LA株的中和抗体效价相似,其变异系数R值为0.279～0.413,证明PRV分离毒株ZJ-01抗原性发生明显变异.本研究为伪狂犬病的防控提供了重要依据.
- 杨文萍顾真庆孙海凤董静侯成才白娟姜平
- 关键词：抗原变异
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定
- 2023年
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是影响世界养猪业的重要病原,为了解析该病毒N蛋白抗原表位,本研究制备获得纯化的重组N蛋白,经过BALB/c小鼠免疫、细胞融合、间接ELISA方法筛选和Western blot鉴定,获得了7株稳定分泌抗PRRSV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,细胞培养上清液抗体效价为1∶800~1∶25600,其中8F1、5E2、2B1、12E1的重链类型为IgG1,4F1、2H2、5A2的重链类型为IgG2b,轻链类型都为κ型。间接免疫荧光试验显示7株单克隆抗体均与PRRSV感染细胞产生反应,可识别3种不同的B细胞线性表位,分别位于47~57 aa、57~67 aa及67~77 aa区域,其中57~67 aa为新发现的抗原表位。本研究结果为PRRSV诊断试剂盒的开发和流行病学调查提供了有用工具。
- 胡晓静张路捷张杰孙海凤白娟姜平
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体抗原表位
- 中国东南部猪伪狂犬病毒超强毒株分离与鉴定
- 伪狂犬病病毒(PRV)引起多种家畜及野生动物以发热、奇痒(猪除外)及脑炎为主要特征的一种传染病。美国与部分欧国家已宣布根除猪伪狂犬病。近30年来,我国广泛使用基因缺失疫苗有效控制并逐步净化。但是,2011年以来,我国许多...
- 顾真庆候成才孙海凤董静姜平白娟
- RNA解螺旋酶A表达系统的探究及其动力学研究
- 2016年
- [目的]RNA解螺旋酶A（RNA helicase A,RHA）参与许多细胞生物学过程中,并能促进艾滋病病毒1型（HIV-1）等一些病毒的复制,本试验旨在探究温度、p H值对RHA的动力学影响。[方法]利用PCR扩增全长RHA基因,构建重组载体p ET-28a-RHA和p Cold-Ⅰ-RHA,分别转化至BL21 star（DE3）和BL21、Rosetta2菌株中,加IPTG分别在28℃和15℃中诱导表达。将全长RHA基因重组到p Fast Bac Dual载体中,然后将重组穿梭载体转化到含有杆状病毒基因组的DH10Bac感受态细胞中,通过转座作用,将RHA基因整合到杆状病毒基因组中。提取重组杆状病毒基因组（重组杆粒DNA）,将重组杆粒DNA转染到sf9细胞中,收集细胞,纯化蛋白,可以得到完整的RHA。建立体外解螺旋反应体系,改变温度、p H值,检测RHA活性的变化。[结果]完整RHA在BL21、Rosetta2中可微量可溶表达。sf9可以表达有活性的完整RHA。反应温度降低时,解螺旋速率变小,RHA活性降低。p H值在6.5-8.0范围内,随着p H值升高,RHA活性升高;当p H值大于8.0时,RHA活性降低。[结论]完整的RHA在BL21、Rosetta2中可微量表达;有3＇-tailed解旋极性的RHA活性受温度、p H影响较大。
- 刘红蕊吴诚诚单衍可谢青云邢刚雷静施志玉孙海凤刘斐
- 关键词：RNAHELICASE大肠杆菌表达系统杆状病毒表达系统PH
- 伪狂犬病病毒gB和gE蛋白单克隆抗体的制备与鉴定被引量：3
- 2015年
- 采用大肠杆菌表达系统表达获得了伪狂犬病病毒(PRV)超强毒株ZJ01的gB和gE重组蛋白,用其免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、克隆和间接ELISA筛选,获得了4株能稳定分泌抗PRV单克隆抗体的杂交瘤细胞,细胞培养上清的ELISA抗体效价在1∶1 600~1∶6 400之间,腹水抗体效价达1∶4×105;连续培养20代,抗体效价基本一致。抗gB单克隆抗体B1B6和B3D7属于IgG2b,抗gE单克隆抗体E1B11和E5C10属于IgG1,轻链均为κ型。Western-blot和IFA结果显示,4株单克隆抗体均能与PRV流行毒株ZJ01、HZ、SD、NJ、LA发生特异性反应,B1B6和B3D7还能与PRV gE基因缺失疫苗毒株Bartha-K61发生反应,但E1B11和E5C10不能与Bartha-K61发生反应。
- 孙海凤顾真庆董静孙涛白娟姜平
- 关键词：伪狂犬病病毒单克隆抗体
- 猪伪狂犬病病毒gB蛋白B细胞表位解析及其阻断ELISA抗体检测方法的建立
- 伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是一种由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的猪、牛、羊等多种哺乳动物的重要传染病，给全球养猪业带来巨大的经济损失。目前，疫苗免疫成为防控伪狂犬病的主...
- 孙海凤
- 关键词：猪伪狂犬病病毒单克隆抗体B细胞表位疫苗免疫
- 文献传递
- 大肠杆菌表达的RNA解螺旋酶Ded1p的提纯与解螺旋机制被引量：1
- 2017年
- [目的]表达、提纯DEx H/D-box家族蛋白Ded1p,并综合传统电泳以及单分子荧光共振能量转移(sm FRET)技术,探究Ded1p的双链RNA解螺旋机制。[方法]原核表达、纯化出全长的Ded1p作为研究蛋白,并验证其解螺旋酶活性。以荧光对标记的带有3'末端单链RNA尾巴的13 bp双链RNA作为研究底物,基于全内反射的单分子荧光共振能量转移技术,在自制的样品通道内添加800 nmol·L-1Ded1p、2 mmol·L-1ATP/Mg2+以及研究底物进行解螺旋试验,再用自编的Matlab程序采集和分析数据,进而从单分子层面探究Ded1p的双链RNA解螺旋机制。[结果]首次通过Ni-NTA凝胶亲和层析与Capto-DEAE凝胶阴离子交换层析两步纯化手段,得到了大量纯净的、并且具有双链RNA解螺旋酶活性的Ded1p。Ded1p的sm FRET试验在单分子层面实现了对Ded1p打开13 bp双链RNA过程的实时观察。通过分析FRET的变化过程,首次提出Ded1p主要以一步解螺旋的方式打开双链RNA结构。[结论]原核表达、纯化的Ded1p具有RNA解螺旋酶活性;该Ded1p是以局部双链打开的模式解开RNA双链。
- 赵富林徐明飞谢青云单衍可雷静施志玉孙海凤刘斐
- 江苏省猪伪狂犬病病毒强毒株的部分基因进化分析与致病性研究被引量：5
- 2018年
- 为研究目前引起江苏省免疫猪场暴发的伪狂犬病病原的毒力变化,本研究通过细胞分离从江苏某猪场发病猪病料样品中获得一株病毒株,将其命名为PRV NJ02,该病毒株的gC和gD基因推导的氨基酸序列与之前报道的病毒株相比分别有7个与2个氨基酸的插入,且g C和g D基因进化树结果显示,该分离株位于相对独立的分支,与传流病毒株PRV LA亲缘关系较远,而与亚洲分离株亲缘关系较近。将PRV NJ02与PRV LA病毒株分别以相同剂量感染100日龄健康猪,结果显示,PRV NJ02分离株滴鼻感染组猪出现明显临床症状,且于感染后6d内全部死亡,其组织病理变化明显,而PRV LA株感染组猪仅表现轻微体温变化和呼吸道症状,其组织病理变化轻微,表明PRV NJ02分离株具有较强的致病性。感染猪各脏器组织中PRV病毒载量结果显示,NJ02株感染猪脑、肺脏和肝脏组织中的病毒含量均高于LA株感染猪的相应组织。以上结果表明,分离株PRV NJ02较传统病毒株PRV LA来说,致病性增强,毒力明显增加。该研究可为江苏省PRV流行株病原学研究提供参考,提示须重视PRV的变异监测。
- 孙海凤董静姜辰龙孙涛白娟姜平
- 关键词：伪狂犬病病毒
