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利用不相容质粒共转化大肠杆菌对Cre重组酶体内重组活性的可视检测被引量：10: 2005年; 源自噬菌体P1的Cre重组酶可以识别 34bp的靶DNA序列loxP ,进行位点特异性的重组反应。为了简便地检测Cre酶在大肠杆菌中的重组活性 ,分别将cre基因和上下游带有loxP的绿色荧光蛋白基因 (gfp)克隆到具有不同抗性的两种不相容质粒中 ,然后将构建的原核表达载体pET30a Cre和pET2 3b loxGFP电击共转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,利用卡那霉素和氨苄青霉素双抗生素抗性进行筛选。通过直接观察转化子的绿色荧光 ,便可以显示Cre酶的体内重组活性 ,并进一步通过SDS PAGE分析、质粒酶切鉴定进行了验证。结果表明 :以gfp为报告基因、通过两种不相容质粒共转化大肠杆菌可以为研究和改进Cre; 庞永奇贾洪革方荣祥郭蔼光陈晓英; 关键词：CRE重组酶共转化绿色荧光蛋白

可视监测Cre酶在大肠杆菌中的重组活性及转基因植物中标记基因的消除: 源自噬菌体P1的Cre/loxP系统目前已被广泛用于原核、真核生物体内与体外DNA重组方面的研究,并且在基因功能的鉴定、基因捕获、染色体工程、特定基因的删除以及外源基因的整合等方面发挥着巨大功能.为了开展该系统的应用研究...; 庞永奇; 关键词：转基因植物选择标记基因绿色荧光蛋白基因卡那霉素抗性; 文献传递

农杆菌接种法作为一种简便的植物病毒载体的侵染方法(英文)被引量：6: 2003年; 烟草花叶病毒(TMV)表达载体30B是一个目前广泛应用的植物病毒表达载体,但用其生产外源蛋白时,必须先将它体外转录成RNA,才能被用来接种宿主植物。由于RNA体外转录费用昂贵、操作复杂,因此限制了30B表达载体的进一步应用。针对这一不足,我们用农杆菌接种法(agroinoculation)接种该病毒载体,即将30B cDNA置于花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子和终止子之间,再将整个表达框架插入到农杆菌T-DNA的左边界和右边界之内,构建成质粒p35S-30B,将转入该质粒的农杆菌注射到植物的叶片中,30B cDNA随T-DNA进入植物细胞后,被转录成可自我复制的RNA形式,进而发生系统侵染。为了检测此接种方式的可行性,绿色荧光蛋白(GFP)报告基因被克隆到p35S-30B中,构建成p35S-30B∶∶GFP,用含有该质粒的农杆菌进行注射操作。证实该病毒载体可通过简便的农杆菌接种法侵染Nicotiana benthamiana,在被接种植物的系统叶中,GFP的表达量可占植物总可溶蛋白的5.2％。; 贾洪革庞永奇庞永奇; 关键词：烟草花叶病毒基因表达

用绿色荧光蛋白监测转基因植物中选择标记基因的消除被引量：15: 2004年; 绿色荧光蛋白 (GFP)可直接进行活体观察 ,它的这个优点可被用于监测转基因植物中选择标记基因的消除。为此 ,构建了植物表达载体pGNG ,将绿色荧光蛋白基因 (gfp)和卡那霉素抗性基因表达盒 (NosP nptII NosT)一起克隆在两个同向的lox位点间 ,在第一个lox位点上游置有CaMV 35S启动子以驱动GFP表达 ,第二个lox位点下游置有不含启动子的大肠杆菌 β 葡萄糖醛酸酶 (GUS)基因。首先在含卡那霉素 (Kan)的培养基上筛选出转pGNG的烟草 ,借助绿色荧光可容易地检出表达GFP的转化体。然后用另一转化载体pCambia130 0 Cre二次转化表达GFP的转基因植物 ,利用另一选择标记基因潮霉素抗性基因 (hpt)进行筛选 ,在获得的再生植株中 ,Cre重组酶的表达消除了转化体中两lox位点间的gfp和nptII。实验结果表明可借助GFP荧光的消失 ,快速选出nptII被消除的二次转化体 ,同时GUS(作为目的蛋白 )在CaMV 35S启动子驱动下获得表达。最后利用后代的分离将hpt和cre除去。; 贾洪革吕玲飞庞永奇陈晓英方荣祥; 关键词：选择标记基因转基因植物绿色荧光蛋白

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庞永奇