毛侃琅
- 作品数：30 被引量：21H指数：4
- 供职机构：深圳市疾病预防控制中心更多>>
- 发文基金：深圳市科技计划项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 促进3β-HSD基因表达的表达载体及其构建方法和应用
- 本发明公开了一种促进3β‑HSD基因表达的表达载体及其构建方法和应用。该表达载体包括慢病毒载体pLVX‑mCMV‑ZsGreen‑PGK‑Puro的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列以及目的基因表达片段。...
- 徐新云王利毛侃琅彭鹏
- 文献传递
- CYP2E1基因过表达细胞株的建立及鉴定
- 2014年
- 目的:应用分子克隆技术,构建CYP2E1基因过表达载体,转染L02肝细胞,建立CYP2E1过表达细胞株并进行鉴定,为深入研究环境和职业毒物的毒作用机制提供模型细胞。方法:根据GenBank提供的CYP2E1基因cDNA序列设计引物,PCR扩增该基因并将其克隆到慢病毒过表达载体pLVX-acGFP1-C1中,将已经构建的慢病毒载体对293FT细胞进行转染,收集病毒上清,感染正常L02肝细胞。用嘌呤霉素进行筛选得到转染CYP2E1基因的L02细胞,通过基因测序、荧光定量PCR和Western blot对细胞株进行鉴定。结果:测序证明重组慢病毒过表达载体CYP2E1基因序列与GenBank提供的CYP2E1序列一致,荧光定量PCR检测转染CYP2E1基因的L02细胞比正常肝细胞CYP2E1 mRNA表达提高273倍,Western blot实验显示转染CYP2E1基因的L02细胞CYP2E1蛋白表达水平比正常肝细胞提高3.2倍。结论:成功构建了CYP2E1基因过表达细胞株,可应用于环境毒物和职业毒物的分子机制研究。
- 徐新云毛侃琅周丽吴德生毛吉炎谢杏秦逍云谭琴
- 关键词：CYP2E1基因慢病毒载体过表达
- 细胞色素氧化酶2E1基因沉默对三氯乙烯致L02肝细胞毒性的影响被引量：5
- 2013年
- 目的通过RNA干扰技术，构建细胞色素氧化酶（CYP）2E1基因慢病毒表达载体，研究CYP2E1基因沉默对三氯乙烯（TCE）致肝细胞毒性的影响。方法设计合成shRNA片段连接到慢病毒载体，筛选单菌落，经聚合酶链式反应（PCR）和测序鉴定后提取质粒，转导L02肝细胞中，筛选CYP2E1缺陷型细胞，利用荧光定量PCR和免疫蛋白印迹法（Westernblot）鉴定干扰效果。以不同浓度（0、0．25、0．50、1．00、2．00、4．00mmol/L）TCE分别对L02肝细胞和CYP2E1基因沉默细胞染毒，测定TCE对2种细胞的存活率及IC50，应用流式细胞仪测定细胞凋亡率，采用实时荧光定量PCR检测细胞凋亡基因和癌基因mRNA表达水平。结果正常L02肝细胞对TCE的IC50为15．1mmol／L，CYP2E1沉默细胞对TCE的IC50为23．6mmol／L。随TCE剂量增加两组细胞凋亡率升高，2．0、4．0mmol／LTCE染毒剂量时，CYP2E1沉默细胞的凋亡率明显低于L02肝细胞组，差异有统计学意义（P〈O．05或P〈0．01）。TCE染毒后CYP2E1沉默细胞的抗凋亡基因Bcl-2表达水平比L02肝细胞升高15％-60％，凋亡基因caspase-3和caspase-9表达水平比L02肝细胞下降30％-60％，差异均有统计学意义（尸〈O．01）。抑癌基因p53表达水平明显高于L02肝细胞，升高81％-278％；癌基因c．fos和k-ras明显低于L02肝细胞组，下降20％～68％，差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论利用慢病毒介导RNA干扰技术成功构建了CYP2E1基因沉默细胞。沉默CYP2E1基因可降低TCE对肝细胞毒性，抑制部分凋亡基因与癌基因表达，提示CYP2E1基因在三氯乙烯代谢过程中发挥重要作用，与三氯乙烯毒性存在一定关系。
- 徐新云毛吉炎毛侃琅刘国红慈捷元杨细飞吴德生黄海燕张然黄新凤
- 关键词：三氯乙烯慢病毒载体基因沉默
- 特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒表达载体及其构建方法与应用
- 本发明提供一种特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒表达载体，包括pLVX-AcGFP1-C1表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和CYP2E1基因cDNA序列；所述多克隆位点包括Xho I...
- 徐新云毛侃琅程锦泉彭朝琼
- 文献传递
- CYP2E1基因RNA干扰载体的构建与表达被引量：4
- 2012年
- 目的:构建CYP2E1基因shRNA慢病毒表达载体,为研究CYP2E1在药物代谢和环境污染物代谢中的作用提供技术支持。方法:通过NCBI检索CYP2E1序列,设计合成3对shRNA片段,退火后连接到慢病毒载体PLKO.1-puro,将重组质粒转化到感受态JM107中。挑取筛选的单菌落,经PCR和测序鉴定后提取质粒。将质粒和包膜蛋白质粒共转染到293FT细胞,收集病毒上清,转导肝细胞L02,利用嘌呤霉素筛选得到CYP2E1缺陷型细胞,最后利用荧光定量PCR和Western blot鉴定干扰效果结果:PCR和测序结果证明双链shRNA已经正确插入慢病毒载体PLKO.1-puro,共转染293FT细胞得到高滴度病毒,转导L02细胞筛选出CYP2E1基因沉默细胞,荧光定量PCR检测shRNA3的最高抑制效率为86.9%,Western blot鉴定shRNA3基本无CYP2F1表达。结论:利用慢病毒介导RNAi技术成功构建了CYP2E1基因沉默细胞。
- 毛吉炎徐新云何晓阳毛侃琅黄海燕刘庆成
- 关键词：CYP2E1RNA干扰慢病毒
- 三氯乙烯所致职业病的发病机制与防治技术研究
- 李智民徐新云张健杰柯跃斌刘国红王金林毛侃琅邱少宏李辉毛吉炎司徒洁刘璐刘健林辉郭妍
- 所属科学技术领域：预防医学与卫生学。主要技术内容：该项目重点开展了三氯乙烯（简称TCE）发病机制研究、临床治疗技术和现场干预措施研究三方面。三氯乙烯发病机制研究：率先开展免疫相关基因、肝代谢酶基因、基因多态性、分子克隆、...
- 关键词：
- 关键词：职业病三氯乙烯发病机制
- 特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒表达载体及其构建方法与应用
- 本发明提供一种特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒表达载体，包括pLVX-AcGFP-C1表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和CYP2E1基因cDNA序列；所述多克隆位点包括XhoI酶切...
- 徐新云毛侃琅程锦泉彭朝琼
- 文献传递
- CYP3A4沉默细胞株建立及其对三氯乙烯毒性的影响被引量：1
- 2014年
- 目的构建CYP3A4基因沉默载体,转染L02肝细胞,建立CYP3A4沉默细胞株并观察其对三氯乙烯毒性的影响。方法根据GenBank提供的CYP3A4基因mRNA序列设计合成shRNA,将shRNA连接到pLKO.1-puro中,将已经构建的慢病毒载体对293FT细胞进行转染,收集病毒上清,感染正常L02肝细胞。用嘌呤霉素进行筛选得到CYP3A4沉默细胞株,通过荧光定量PCR和Western blot对细胞株进行鉴定。用不同剂量三氯乙烯对正常L02肝细胞和CYP3A4沉默细胞进行染毒12h,观察凋亡基因(Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9)和癌基因(c-fos、c-myc、K-ras、p53)表达变化。结果测序证明插入pLKO.1-puro载体的干扰序列与设计的序列一致,荧光定量PCR检测CYP3A4沉默细胞CYP3A4基因表达比正常L02肝细胞下降77.3%,Western blot实验显示CYP3A4沉默细胞CYP3A4蛋白表达水平比正常L02肝细胞下降84.6%。CYP3A4沉默细胞经三氯乙烯染毒后Bcl-2表达水平显著高于L02细胞的表达水平;Caspase-3表达水平无明显改变;Caspase-8仅在TCE高剂量组表达下降;Caspase-9在TCE剂量≥1.0 mmol/L表达水平下降;癌基因c-fos、c-myc、k-ras和p53表达水平都有一定程度下降,部分剂量组存在显著差异(P<0.05或P<0.01)。结论三氯乙烯对正常肝细胞和CYP3A4沉默细胞凋亡基因和癌基因表达存在明显差异,提示CYP3A4是三氯乙烯在体内代谢的重要因素,与三氯乙烯毒性存在一定关系。
- 徐新云毛侃琅袁建辉毛吉炎吴德生黄海燕谢杏秦逍云谭琴
- 关键词：肝细胞CYP3A4慢病毒载体三氯乙烯
- CYP3A4基因沉默和高表达对三氯乙烯致肝细胞毒性的影响
- 目的 建立CYP3A4沉默细胞株和CYP3A4高表达细胞株,观察CYP3A4基因沉默和高表达对三氯乙烯致肝细胞毒性的影响.方法 根据GenBank提供的CYP3A4基因mRNA序列设计合成shRNA,将shRNA连接到质...
- 徐新云毛侃琅毛吉炎
- 关键词：三氯乙烯CYP3A4基因沉默基因高表达分子克隆
- CYP2E1基因沉默对三氯乙烯致肝细胞毒性的影响
- 【目的】三氯乙烯(TCE)是目前工业上常使用的有机溶剂,部分接触者可发生TCE中毒或严重的药疹样皮炎甚至死亡,是广东珠三角地区严重的职业病危害因素之一。为了深入研究TCE的发病机制,本文应用RNA干扰技术,构建CYP2E...
- 徐新云毛吉炎毛侃琅
- 关键词：三氯乙烯CYP2E1慢病毒载体
- 文献传递
