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凌媛: 作品数：11 被引量：12H指数：3; 供职机构：北京生物制品研究所有限责任公司更多>>; 发文基金：国家科技重大专项艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治专项“重大新药创制”科技重大专项更多>>; 相关领域：医药卫生生物学更多>>

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大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的原核表达、纯化及其黏膜免疫佐剂作用被引量：1: 2011年; 目的原核表达、纯化大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(Heat-labile enterotoxin B subunit,LTB),并评价其黏膜免疫的佐剂作用。方法从产毒素大肠杆菌44815菌株中扩增出LTB基因,克隆至质粒pET-32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-LTB,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,表达的LTB经纯化后进行神经节苷脂GM1结合活性及黏膜免疫佐剂活性鉴定。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确;重组LTB主要为可溶性表达,表达量约占菌体总蛋白的15%;纯化的LTB纯度可达95%以上,可与兔抗CTB血清发生特异性反应,且具有GM1结合活性及良好的黏膜免疫佐剂活性。结论在大肠杆菌中成功表达了重组LTB蛋白,纯化的LTB具有良好的黏膜免疫佐剂活性。; 崔文禹李媛媛单璞凌媛李计来徐静

脑心肌炎病毒实验性疫苗免疫原性初步研究被引量：1: 2013年; 目的：制备脑心肌炎病毒（ EMCV）实验性疫苗并对其免疫原性进行初步研究。方法采用Vero细胞培养EMCV病毒，微量细胞病变法检测病毒滴度；经过浓缩、过滤、超速离心等方法初步纯化EMCV；摸索病毒灭活方法；确定病毒半数致死量（ LD50）；通过肌肉注射途径免疫小鼠，微量中和试验测定血清中和抗体效价；免疫后小鼠分别以100LD50、50LD50和25LD50进行腹腔攻毒试验。结果以1∶4000β-丙内酯4℃放置12 h作为病毒灭活条件，病毒半数致死量17 CCID50/ml；免疫小鼠能检测到中和抗体并对病毒攻击具有抵抗力。结论 EMCV实验性疫苗能诱导小鼠产生保护性抗体。; 徐静李树香刘敬王欣怡岳野凌媛; 关键词：脑心肌炎病毒免疫原性半数致死量

重组痘苗病毒艾滋病疫苗细胞免疫检测方法的优化: 目的:对评价重组痘苗病毒艾滋病疫苗细胞免疫水平的方法进行优化,确定稳定的疫苗细胞免疫ELISPOT检测方法。方法:重组痘苗病毒艾滋病疫苗经皮内途径接种BALB/c小鼠,6周采集小鼠的脾细胞分别用ICS和ELISPOT方法...; 李媛媛凌媛马志新徐静; 关键词：痘苗病毒艾滋病疫苗细胞免疫 ELISPOT; 文献传递

抗人肿瘤坏死因子-α人源单克隆抗体在CHO细胞中的表达及鉴定被引量：4: 2014年; 目的在CHO细胞中表达抗人肿瘤坏死因子(human tumor necrosis factor-alpha,h TNF-α)人源单克隆抗体,并对抗体纯化后进行鉴定。方法将含有编码抗h TNF-α人源单克隆抗体轻、重链可变区及恒定区基因的真核表达质粒p HL,利用脂质体Lipofectamine TM 2000转染CHODG44细胞,经氨甲喋呤(methotrexate,MTX)加压筛选和单克隆筛选,获得分泌表达抗h TNF-α人源单克隆抗体的CHO细胞株。应用Mab Select Su Re和Capto adhere两步层析纯化抗体后,分析抗体的纯度、N-末端序列、结合动力学平衡常数及中和活性。结果经两步层析后,抗h TNF-α人源单抗经SDS-PAGE分析,可见纯度较好的抗体重链、轻链和完整抗体条带,SEC-HPLC纯度为98.79%;抗体的轻、重链N-末端氨基酸序列与预期一致,其结合动力学平衡常数(KD)为1.34×10-10 M,能拮抗TNF-α对L929细胞的杀伤作用,对TNF-α细胞毒的中和率达90%左右。结论在CHO细胞中成功表达了具有较好中和活性的抗h TNF-α人源单克隆抗体。; 崔文禹李计来凌媛李树香刘敬王欣怡徐静张云涛; 关键词：肿瘤坏死因子-Α 单克隆抗体 CHO细胞

病毒相关碳水化合物的研究进展: 2013年; 碳水化合物的作用已经超过了传统意义上的能量来源和结构聚合物，相关研究不再局限于细菌类疫苗。随着糖化学和免疫学的快速发展，碳水化合物的研究推动了抗肿瘤、抗寄生虫、抗病毒等疫苗及药物的研发。此文仅对基于碳水化合物的研究在抗病毒如人类免疫缺陷病毒、流感病毒、丙型肝炎病毒、冠状病毒方面的进展进行综述。; 凌媛徐静; 关键词：病毒碳水化合物疫苗

结晶紫蚀斑法检测重组痘苗病毒艾滋病疫苗病毒滴度方法的建立被引量：2: 2011年; 目的建立重组天坛株痘苗病毒（rTV）艾滋病疫苗的结晶紫蚀斑病毒滴度检测方法，为rTV艾滋病疫苗病毒滴度测定提供更稳定的方法。方法通过对Vero细胞浓度、病毒吸附时间及温度、病变判定时间等方面进行优化，建立rTV艾滋病疫苗病毒滴度的结晶紫蚀斑检测方法，并应用BioSpotReader进行蚀斑计数及分析，比对仪器蚀斑计数和人工蚀斑计数的相关性；应用血球吸附法、中性红蚀斑、结晶紫蚀斑3种方法，对多批rTV艾滋病疫苗及天坛株痘病毒滴度进行检定，进行3种方法的相关性分析；采用结晶紫蚀斑法重复测定样品，计算变异系数（CV），对方法的精密性进行验证；采用SPSSl7．0软件对实验数据进行统计分析。结果确定Vero细胞浓度为5．O×10^5～9．O×10^5个／ml时，病毒37℃吸附2h后加入含甲基纤维素的维持液，培养72h，应用BioSpotReader进行蚀斑计数，与人工计数的相关系数r=0．985，能客观反映不同大小的病毒蚀斑，降低了人工计数引起的非客观因素误差；经过3种方法对不同批次的rTV艾滋病疫苗及天坛株痘病毒进行病毒滴度检定，结晶紫蚀斑与血吸附法的相关系数r=0．997，结晶紫蚀斑法与中性红蚀斑法相关系数r=0．980（P〈0．01），具有高度相关性。结论建立了可用于rTV艾滋病疫苗病毒滴度检测的结晶紫蚀斑方法。; 李媛媛凌媛马志新王锡岩徐静; 关键词：痘苗病毒艾滋病疫苗病毒滴度

脑心肌炎病毒鉴定方法的初步研究被引量：1: 2013年; 目的摸索建立脑心肌炎病毒（EMCV）鉴定方法。方法根据GenBank中EMCVVR．129B序列设计引物，提取病毒RNA，进行RT．PCR，琼脂糖凝胶电泳检测片段大小。将DNA测序结果与GenBank中相同毒株EMCV序列进行比对。以RK细胞培养的全病毒作为免疫原制备抗血清，用于建立间接免疫荧光试验（IIFA）及中和试验方法，并验证方法精密性和特异性。制备抗GST—VPl和抗GST．VP2多克隆抗体，与EMCV浓缩液进行免疫印迹反应。结果获得的DNA片段与GenBank中上传的相同毒株EMCV序列进行比对，相似性为98％-100％。采用20100901批抗血清160倍稀释作为一抗，建立IIFA方法，特异性好。检测20100901批抗血清中和效价1：30211，建立的固定病毒．稀释血清中和试验方法特异性、精密性好。抗GST—VPl和GST—VP2抗体与EMCV浓缩液于相对分子质量为33x103左右分别出现清晰单一条带，与理论值相符。结论初步建立了用于EMCV毒株鉴定的RT-PCR、间接免疫荧光、中和试验及免疫印迹方法。; 徐静李树香岳野王欣怡刘敬凌媛许丽锋; 关键词：脑心肌炎病毒间接免疫荧光

重组痘苗病毒艾滋病疫苗细胞免疫水平ELISPOT检测方法的建立被引量：3: 2011年; 目的建立检测重组痘苗病毒(Recombinant Tiantan vaccinia,rTV)艾滋病疫苗细胞免疫水平的ELISPOT方法。方法 rTV艾滋病疫苗经皮内注射BALB/c小鼠,免疫后1～6周,采集小鼠脾细胞,ELISPOT法检测小鼠细胞免疫水平,确定最佳检测时间,并对免疫剂量、肽库刺激浓度进行优化。应用ELISPOT方法对3批rTV疫苗成品进行检测,验证该方法的适用性;按现行检定标准对同批疫苗进行重复检测,验证该方法的重复性;应用ELISPOT和ICS方法同时对rTV疫苗进行检测,验证该方法与ICS法的相关性。结果 rTV艾滋病疫苗最佳免疫剂量为50μl/只,免疫后4周,混合多肽库刺激终浓度为4μg/ml,淋巴细胞分泌IFNγ的水平较高;ELISPOT法适用性和重复性较好,且与ICS法具有较好的相关性(r=0.767,P<0.05)。结论已成功建立了检测重组痘苗病毒艾滋病疫苗细胞免疫水平的ELISPOT方法。; 李媛媛凌媛马志新徐静; 关键词：痘苗病毒艾滋病疫苗细胞免疫 ELISPOT

不同佐剂流感疫苗的小鼠免疫效果: 2012年; 目的评价不同佐剂流感疫苗的小鼠免疫效果。方法培养并纯化流感病毒鼠肺适应株PR/8/34,制备流感病毒裂解液。将BALB/c小鼠随机分为5组:流感病毒PR/8/34裂解液(HA)组、HA+大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位(Heat-labile exterotoxin B subunit,LTB)组、HA+弗氏不完全佐剂(FIA)组、HA+A(lOH)3组和生理盐水对照组,HA+LTB组采用滴鼻黏膜免疫,免疫剂量为50μl/只,其余各组均采用肌肉注射,免疫剂量为100μl/只,共免疫2次,间隔2周。于初次免疫后28 d,经小鼠眼内眦采血,分离血清,检测各组小鼠血清IgG抗体效价、血凝抑制效价及攻毒后保护力及鼠肺病毒RNA载量,评价不同佐剂对流感疫苗的免疫增强作用。结果各佐剂组小鼠血清IgG抗体水平及血凝抑制效价均显著高于HA组,且差异均有统计学意义(P均<0.01);HA+FIA组小鼠血清IgG抗体水平及血凝抑制效价均显著高于HA+LTB组和HA+A(lOH)3组(P均<0.01);HA+LTB组与HA+A(l OH)3组抗体效价差异无统计学意义(P>0.05)。各佐剂组和HA组小鼠攻毒后均存活,HA+FIA组鼠肺病毒RNA载量最低,HA+LTB组与HA+A(lOH)3组相当。结论不同佐剂对流感疫苗均有一定的免疫增强作用,其中LTB滴鼻免疫和A(lOH)3肌肉注射对流感疫苗的免疫增强作用相当。; 单璞徐立猛李计来李媛媛凌媛马志新徐静; 关键词：流感疫苗佐剂小鼠免疫效果

抗血管内皮生长因子鼠-人嵌合抗体真核表达载体的构建及在CHO DG44细胞中的表达被引量：3: 2014年; 目的构建抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)鼠-人嵌合抗体真核表达载体,并在CHO DG44细胞中进行表达及初步鉴定。方法分别采用鸡胚尿囊膜试验和小鼠肿瘤抑制试验检测鼠抗人VEGF单克隆抗体2E5对VEGF促血管生成和肿瘤增生的抑制作用;采用RT-PCR法从鼠源性抗VEGF单克隆抗体的杂交瘤细胞2E5中扩增抗VEGF抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),利用IMGT数据库进行序列比对分析,筛选出功能性基因;采用重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,SOE PCR)将VH基因与人Ig G1重链恒定区基因连接,VL基因与人Ig G1轻链恒定区基因连接,分别构建嵌合抗体重链基因和轻链基因,将嵌合的重链基因连入p Opti VECTM-TOPO誖TA载体,轻链基因连入pc DNATM3.3-TOPO誖TA载体,构建重链表达质粒p Opti VEC-H和轻链表达质粒pc DNA 3.3-L;采用脂质体法将重链和轻链表达质粒共转染CHO DG44细胞,经缺陷性培养基筛选和抗性标记筛选、MTX加压后,利用有限稀释法挑选单细胞株,ELISA法检测嵌合抗体的表达量;取批次培养的嵌合抗体细胞株上清液,经Mab Select Sure亲和纯化和陶瓷羟基磷灰石纯化后,对纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE和高效液相色谱分析,并测定N-端序列、分子量和解离常数。结果鼠抗人VEGF单克隆抗体2E5能抑制VEGF的促血管生成和肿瘤生长。嵌合表达载体p Opti VEC-H和pc DNA 3.3-L经菌落PCR及测序证实构建正确。经缺陷性培养基筛选、抗性标记筛选、MTX加压及单克隆筛选后,嵌合抗体的表达量可达68.5μg/ml。纯化的嵌合抗体纯度达99%以上;N-端测序结果与预期重、轻链N-端氨基酸序列一致;质谱法测定分子量为149 290;解离常数为2×10-9 mol/L。结论成功构建了抗VEGF鼠-人嵌合抗体轻、重链表达载体,在CHO DG44细胞中表达了嵌合抗体,经层析纯化的嵌合抗体纯度较高,与VEGF抗原具有较强的亲和力; 陈刚李计来崔文禹凌媛徐静张云涛; 关键词：血管内皮生长因子嵌合抗体 CHO细胞

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