王健
- 作品数：16 被引量：27H指数：4
- 供职机构：北京生物制品研究所有限责任公司更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治专项国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 不同佐剂对随机组合多表位恶性疟疾疫苗M. RCAg-1的免疫原性及体外抑虫率影响的研究被引量：5
- 2011年
- 目的 研究弗氏佐剂及3种人用佐剂[Al（OH）3、Montanide ISA720、Montanide ISA51]对重组多表位蛋白M.RCAg-1（malaria random constructed antigen-1）在BALB/c小鼠及新西兰大白兔体内产生免疫效果的影响.方法 以弗氏佐剂、Al（ OH）3佐剂、Montanide ISA720以及MontanideISA51佐剂分别与M.RCAg-1蛋白进行配伍,分别免疫BALB/c小鼠及新西兰白兔；采用ELISA法检测M.RCAg-1蛋白及其所组成各个表位特异的血清IgG含量；间接荧光免疫试验分析不同配伍组免疫血清对天然疟原虫抗原的识别；酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测特异性鼠T淋巴细胞的活化；另借助生物传感器评价抗原与不同佐剂配伍组血清的亲和力,并用体外生长抑制试验（GIA）对恶性疟原虫的体外生长的影响进行评价.结果 不同佐剂可诱发不同水平的抗体滴度,Montanide ISA51佐剂配伍组的效果与弗氏佐剂组最为接近,并可使蛋白包含的11个表位肽能都较好诱发出特异性抗体,可有效激发以IFN-γ为主的细胞免疫应答,而且Montanide ISA51佐剂组免疫产生的抗体和M.RCAg-1蛋白质的亲和力高于其他两种佐剂；而Montanide ISA720佐剂和Al（OH）3佐剂免疫组不能诱发小鼠产生显著的IFN-γ反应（P＞0.05）.Montanide ISA51配伍蛋白质免疫产生的IgG在浓度为2mg/ml时对3D7和Dd2的抑制率分别为60%和100%,Al（OH）3佐剂组免疫兔血清IgG体外抑虫率较低（10%左右）,而Montanide ISA720佐剂免疫组血清不能有效抑制疟原虫生长.结论 通过比较3种人用佐剂和弗氏佐剂对BALB/c小鼠和新西兰兔的免疫辅助效能显示,Montanide ISA51佐剂能很好的辅助M.RCAg-1蛋白疫苗诱发动物体内的体液免疫和细胞免疫应答,可做为疫苗的候选佐剂之一.
- 王健蔺亚辉孙成金李莉莉陈祥鹏李军王恒张振龙
- 关键词：佐剂疟疾疫苗
- 不可分型流感嗜血杆菌的特性及抗原筛选研究进展
- 2009年
- 不可分型流感嗜血杆菌（nontypeable Haemophilus influenzae，NTHi）是一类没有荚膜的革兰阴性球杆菌，常寄居于人类上呼吸道，是重要的机会致病菌，能引起人类中耳炎、肺炎及反复发作的呼吸道感染等。目前还没有一种预防这种病原菌感染的疫苗，随着近几年抗生素的滥用，细菌的耐药性问题越发突出，这就使开发一种安全有效的疫苗显得尤为重要。此文对NTHi的致病性、菌株特点及其抗原筛选的研究进展作一概述。
- 陈祥鹏王健张振龙
- 关键词：抗原脂多糖类
- 不可分型流感嗜血杆菌外膜蛋白P6的重组表达及免疫保护作用研究被引量：6
- 2010年
- 目的研究不可分型流感嗜血杆菌（NTHi）重组外膜蛋白P6的理化性质和对小鼠的免疫保护作用。方法利用PCR技术，以NTHi基因组为模板，扩增出编码外膜蛋白P6的基因片段；构建pET-32a—P6重组质粒；转化到大肠杆菌B121（DE3）中进行表达，并对表达条件进行了优化。通过阴离子交换和凝胶过滤层析对蛋白进行纯化。经SDS—PAGE、Western blot等对蛋白的理化性质进行初步分析，继而免疫BALB／c小鼠，用同源菌经腹腔攻击，比较免疫组和对照组小鼠死亡率。结果实现了该蛋白在大肠杆菌中的高效表达，产物表达形式为可溶性表达，纯化后蛋白纯度可达95％，收率可达5mg／g（蛋白／湿菌），相对分子质量（Mr）为14145．848，Western blot证实重组P6蛋白能与菌源提纯P6蛋白免疫小鼠后的抗血清发生特异性反应。动物实验结果表明重组P6蛋白在小鼠体内能诱生高滴度的抗体，显示免疫组小鼠存活率明显高于对照组（P〈0．01）。结论重组NTHi外膜蛋白P6的原核表达产物为可溶性蛋白，在小鼠体内能诱生高效价抗体，在小鼠感染模型中具有保护作用，为NTHi疫苗的研发提供了基础资料。
- 陈祥鹏王健李莉莉陈敬张振龙
- 关键词：不可分型流感嗜血杆菌外膜蛋白克隆表达免疫保护
- 转铁蛋白-PEG-睫状神经营养因子的制备及其生物活性评价被引量：3
- 2016年
- 为了实现在体内更持久的药效作用,根据睫状神经营养因子CNTF第17位为游离半胱氨酸残基,而转铁蛋白Tf无游离半胱氨酸的特点,采用N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇5K-马来酰亚胺(NHS-PEG5k-MAL)作为偶联剂,实现了两者定点偶联,然后结合蛋白自身特性制定纯化方法,制备获得纯度高于90%的转铁蛋白-聚乙二醇5k-睫状神经营养因子(Tf-PEG5k-CNTF)耦合物。高效凝胶色谱和动态光散射分析显示耦合物的表观分子体积大于两蛋白之和。细胞试验结果显示耦合物的活性下降至原蛋白的65.8%。大鼠药代动力学试验显示Tf-PEG5k-CNTF耦合物在体内的代谢半衰期延长至8.2小时,与CNTF原蛋白相比提高了约17倍。小鼠动物试验显示在每周2次的给药频率,每次1.0 mg/kg的剂量下,Tf-PEG5k-CNTF能更为显著地影响小鼠对食物摄入量和减轻体重。因此,转铁蛋白偶联技术可用于脑部靶向蛋白药物的长效递送。
- 殷爽冯翠张纯王祺王健余蓉刘永东苏志国
- 关键词：转铁蛋白睫状神经营养因子减肥
- 肺炎链球菌蛋白疫苗候选蛋白研究进展
- 2012年
- 肺炎链球菌能够引起肺炎、脑膜炎、中耳炎等疾病,在世界范围内具有很高的致病率和致死率。患者主要集中在婴幼儿、老年人和免疫力低下的人群。据统计,每年大约有一百万的五岁以下儿童死于肺炎链球菌引起的疾病。抗生素是肺炎链球菌引起疾病最常用的治疗药物,但是,耐青霉素和多重耐药菌的出现使这些疾病的治疗难度大大增加，同时，
- 李莉莉郑凡王健
- 关键词：肺炎链球菌蛋白疫苗治疗药物免疫力低下多重耐药菌耐青霉素
- 重组靶向性抗肿瘤融合蛋白EGF-E4orf4毕赤酵母工程菌中试发酵工艺的建立
- 2011年
- 目的建立重组靶向性抗肿瘤融合蛋白EGF-E4orf4毕赤酵母工程菌的中试发酵工艺。方法优化EGF-E4orf4工程菌二级种子培养时间,按5%的比例接种于20 L发酵培养基,设定培养阶段温度为30℃,诱导表达阶段温度为28℃,在发酵过程中通过调节搅拌速度、通气量和罐压等措施使DO维持在20%～35%,采用三步发酵法进行发酵,优化诱导pH值及诱导时间,并在已优化的工艺条件下,稳定发酵3批。结果确定二级种子的培养时间为15 h,最适诱导pH值为6.0,最适诱导时间为48 h;中试发酵3批,菌体A600均值达(327.67±17.96),菌体湿重均值达(308.33±9.07)g/L,EGF-E4orf4表达量均值为(200.00±5.57)mg/L。结论已初步建立了重组EGF-E4orf4毕赤酵母工程菌的中试发酵工艺,为EGF-E4orf4的产业化奠定了基础。
- 孙成金王健崔春青郭鹏陈祥鹏张振龙
- 关键词：毕赤酵母发酵
- 不同佐剂及免疫途径对重组NTHi外膜蛋白P6免疫效果影响的研究
- 2011年
- 目的研究几种佐剂及免疫途径对重组NTHiP6蛋白抗原在小鼠体内产生的免疫效果的影响。方法以A1（OH）、佐剂、CpGODN佐剂以及两种联合的复合佐荆分别与rP6蛋白混合，经滴鼻、肌肉注射免疫途径免疫6周龄雌性BALB／c小鼠；相间剂量、免疫途径加强免疫2次。采用ELISA法检测rP6蛋白特异的血清IgG和黏膜IgA滴度；酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测特异性T淋巴细胞的活化。结果3次免疫后，CpGODN＋rP6滴鼻免疫组和AI（OH），＋CpGODN＋rP6肌肉注射免疫组产生高滴度的特异性血清IgG抗体（F=41．259，P=0．000）。同时ELISPOT试验显示，CpGODN＋rP6无论通过滴鼻还足肌肉注射免疫均能诱导大量抗原特异性T淋巴细胞的活化，与其他实验组比较差异有统计学意义（F=66．046，P=0．000）。而且CpGODN＋rP6滴鼻免疫组能诱发高滴度的特异性黏膜IgA抗体（F=70．966，P=0．000）。结论重组NTHi外膜蛋白P6与CpGODN佐剂联合后经黏膜途径免疫，小但能保证体液免疫的高滴度血清IgG抗体，而且能从黏膜免疫和细胞免疫两方面对该蛋门的免疫效果进行增强。
- 陈祥鸭王健王涛李莉莉张振龙
- 关键词：CPGODN佐剂免疫途径体液免疫
- 重组人睫状神经营养因子纯化工艺的建立被引量：2
- 2016年
- 目的建立适于生产应用的重组人睫状神经营养因子(recombinant human ciliary neurotrophic factor,rh CNTF)纯化工艺,并对纯化产物进行鉴定。方法将CNTFnew CC22突变体工程菌BL21(DE3)菌体破碎上清经25%饱和度硫酸铵沉淀后,沉淀上清先后经Butyl HP疏水层析和Q HP阴离子交换层析进行纯化。通过非还原SDS-PAGE和反相高效液相色谱分析(RP-HPLC)检测样品纯度;质谱法测定rh CNTF的相对分子质量;Edman化学降解法测定rh CNTF的N-端氨基酸序列;TF-1细胞/CCK-8比色法和对饮食诱导性肥胖(diet-induced obesity,DDIO)大鼠的减肥作用分别测定rh CNTF的体外和体内生物学活性。结果纯化后rh CNTF的纯度可达99.6%,纯化回收率为34.5%;相对分子质量为21 153;N-端15个氨基酸序列为Ala-Phe-Thr-Glu-His-Ser-Pro-Leu-Thr-Pro-His-Arg-Arg-Asp-Leu;生物学比活性高于2×106 IU/mg,并能有效降低DIO大鼠体重。结论经3步纯化成功获得了高纯度的rh CNTF,为进一步对其性质、功能和生产应用研究奠定了基础。
- 刘君蔡觅郑秀玉张夕燕王健张振龙
- 关键词：纯化大肠埃希菌减肥
- 融合表达对人工重组多表位蛋白M．RCAg-1构象及免疫效能影响的研究被引量：1
- 2012年
- 目的研究载体融合肽段对人工重组多表位蛋白M．RCAg-1构象、免疫原性及体外保护性的影响。方法将人工多表位抗原M．RCAg-1基因通过不同的酶切位点克隆到原核表达载体pDS—ex上，从而获得带有不同载体融合标签或没有标签的蛋白，表达产物经纯化得到P312-1、P312—2、P312-3这3种多表位蛋白，利用生物信息学和色谱技术对制备的3种蛋白的二级及三级结构进行了分析，并将这3种纯度大于95％的重组蛋白与弗氏佐剂乳化后分别免疫接种小鼠和新西兰白兔，免疫后血清按常规进行ELISA间接法检测抗体滴度，采用酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测分泌细胞因子的特异性淋巴细胞克隆数，同时进行了间接免疫荧光分析（IFA）以及对体外培养的恶性疟原虫的生长抑制试验（GIA）。结果P312—1、P312-2、P312-3这3种多表位蛋自在动物模型体内诱导的抗体滴度水平并无差异（P〉0．05），但蛋白免疫小鼠后却诱导了不同类型的T细胞反应，而且3种蛋白免疫血清IgG体外生长抑制率出现明显差异（分别为93．9％、14．7％、54．3％）。利用生物信息学和色谱技术分析，发现从不同表达载体制备的重组蛋白在二级和三级结构上出现极大差异，预测蛋白质分子的空间构象发生了改变，而且一些表位在分子中的位置也有明显的改变。结论不同的载体肽融合表达对多表位蛋白M．RCAg-1结构及免疫活性的影响会产生不同的作用，直接影响多表位蛋白的构象，进而会增强或抑制多表位蛋白的免疫效应。
- 王健蔺亚辉陈祥鹏李莉莉李军王恒张振龙
- 随机组合多表位恶性疟疾疫苗M.RCAg-1蛋白的纯化及鉴定被引量：1
- 2011年
- 目的纯化随机组合多表位恶性疟疾疫苗M.RCAg-1蛋白,并进行各项鉴定。方法对BL21(DE3)-M.RCAg-1/pDS-ex工程菌发酵产物进行纯化,对纯化的M.RCAg-1蛋白进行各种理化性质鉴定;采用Western blot法检测其反应原性;以不同剂量的M.RCAg-1蛋白免疫BALB/c小鼠及新西兰大白兔,采用间接ELISA法检测小鼠血清抗体效价;间接荧光免疫法(IFA)分析免疫血清对天然疟原虫抗原的识别;酶联免疫斑点试验检测特异性鼠T淋巴细胞的活化及细胞因子的分泌;体外生长抑制试验检测免疫兔血清对恶性疟原虫生长的影响。结果 M.RCAg-1蛋白表达量约为菌体总蛋白的30%,浓度为1.5 mg/ml,纯度可达95%左右,等电点为5.0;内毒素残留量均小于2.5 EU/mg,宿主蛋白残留量为0.08%,N-末端氨基酸序列正确;可与相应鼠单抗特异性结合;免疫小鼠血清抗体水平随着免疫次数和免疫剂量的增加而升高,20及30μg剂量组在末次免疫后,血清抗体滴度均可达1∶1 031 707;各免疫组小鼠血清均能识别恶性疟原虫天然抗原,且呈抗原剂量依赖性;10、20和30μg剂量组能刺激相应特异性脾淋巴细胞显著增殖(P<0.01)及分泌IFNγ和IL-4(P<0.01),并能较好地抑制疟原虫体外生长。结论纯化的M.RCAg-1蛋白理化性质稳定,具有较强的免疫原性,能激发可持续、高滴度的特异性抗体,并能诱发显著的T细胞应答,是极具潜力的候选疫苗蛋白,具有较好的开发前景。
- 王健孙成金李莉莉陈祥鹏李军王恒张振龙
- 关键词：疟疾疫苗
