都建
- 作品数：40 被引量：82H指数：4
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- 相关领域：医药卫生农业科学生物学文化科学更多>>
- 纺锤体微管与动点粘连的分子解析
- 细胞生命过程中遗传物质的稳定性是通过有丝分裂过程中染色体在两个子细胞中的均等分配而实施的。细胞有丝分裂纺锤体微管与着丝粒的粘连是通过动点--组装在着丝粒上的一个巨大的蛋白质复合物而实现的。
高度动态的纺锤体微管...
- 都建
- 关键词：细胞遗传学染色体
- 刚地弓形虫巨噬细胞迁移抑制因子基因敲除虫株的构建与鉴定被引量：1
- 2022年
- 目的构建并鉴定刚地弓形虫RH株巨噬细胞迁移抑制因子(Tgmif)基因敲除虫株。方法设计刚地弓形虫RH株Tgmif的单向导RNA(sgRNA)和点突变引物,将pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT质粒定点突变为针对Tgmif基因的pSAG1::Cas9-U6::sg Tgmif质粒。构建含有Tgmif上游1001 bp(Tgmif-up)、二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶基因(dhfr-ts)和Tgmif下游1011 bp(Tgmif-down)等3个片段的Tgmif供体质粒,从Tgmif供体质粒PCR扩增获得Tgmif供体DNA。将pSAG1::Cas9-U6::sg Tgmif质粒和Tgmif供体DNA混合后电击转染野生型刚地弓形虫RH株(RH_(WT))速殖子,用乙胺嘧啶培养7 d,筛选获得稳定表达乙胺嘧啶抗性的虫株并进行单克隆筛选,PCR扩增dhfr-ts上、下游同源臂和Tgmif鉴定Tgmif基因敲除单克隆株(RH_(ΔTgmif))。提取RH_(ΔTgmif)和RH_(WT)株虫体蛋白,蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析TgMIF蛋白的表达情况。RH_(ΔTgmif)在人包皮成纤维(HFF)细胞中传代10代,吉氏染色,镜检计数100个HFF中速殖子数,评估RH_(ΔTgmif)在体外培养HFF细胞中的增殖能力,以RH_(WT)为对照。将20只BABL/c小鼠随机分为RH_(WT)组和RH_(ΔTgmif)组(10只/组),各组分别腹腔注射RH_(WT)或RH_(ΔTgmif)株速殖子(1000个/鼠),记录小鼠生存情况。弓形虫增殖能力的比较采用独立样本t检验,小鼠生存率的比较采用Log Rank检验。结果PCR检测结果显示,含Tgmif-up、dhfr-ts和Tgmif-down等3个片段的Tgmif供体DNA片段长5049 bp,与预期相符;RH_(ΔTgmif)株分别扩增出1387、1524 bp的dhfr-ts上、下游同源臂条带,RH_(WT)株无相应条带;RH_(WT)株扩增出1837 bp的Tgmif条带,RH_(ΔTgmif)株无相应条带。Western blotting分析结果显示,RH_(WT)株在相对分子质量(M_(r))12500处出现1条蛋白条带,RH_(ΔTgmif)株无相应的蛋白条带。吉氏染色镜检结果显示,100个HFF中RH_(ΔTgmif)株速殖子为(2986±69.20)个,高于RH_(WT)株的(2067±51.08)个(t=18.50,P<0.01)。体内毒力试验结果显示,RH_(WT)组小鼠在第7天出
- 王杰温红阳陈滢安然罗庆礼沈继龙都建
- 关键词：刚地弓形虫巨噬细胞迁移抑制因子基因敲除
- 高表达毒力因子ROP18的转基因刚地弓形虫株的建立及鉴定
- 2015年
- 目的构建并鉴定高表达毒力因子ROP18的转基因刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)虫株。方法 RTPCR扩增刚地弓形虫RH株速殖子的ROP18基因片段。将纯化的PCR产物克隆至p CR-BluntⅡ-Topo载体构建p ROP18质粒,PCR扩增ROP18基因序列。将纯化的PCR产物亚克隆至p TUB8-myc GFPPftail-Ty1载体,构建p TUB8-ROP18-Ty1质粒。将质粒电穿孔转染刚地弓形虫RH株,刚地弓形虫悬液转移到长有贴壁细胞的培养瓶中培养,用含25μg/ml霉酚酸和50μg/ml黄嘌呤的DMEM培养基筛选高表达ROP18的刚地弓形虫RH株。免疫荧光和蛋白质印迹(Western blotting)检测ROP18在转基因刚地弓形虫株中的表达。吉氏染色比较弓形虫RH株和高表达ROP18的转基因RH株弓形虫分别感染人包皮成纤维细胞(HFF细胞)的增殖情况。20只昆明小鼠均分为2组,每鼠分别腹腔内注射1×103高表达ROP18弓形虫RH株和1×103弓形虫RH株,统计小鼠存活率。结果 RT-PCR扩增出1 665 bp的ROP18基因序列。经酶切和测序鉴定证明p TUB8-ROP18-Ty1质粒构建成功。Western blotting分析结果显示,高表达ROP18 RH株可表达相对分子质量(Mr)为56 000的蛋白,与ROP18-Ty1蛋白预期结果一致。免疫荧光结果发现,ROP18-Ty1定位于弓形虫前端的棒状体。吉氏染色结果表明,高表达ROP18 RH株弓形虫感染HFF细胞6、12和24 h后的速殖子数量分别为100.0±16.9、476.0±31.1和860.0±52.3,均显著高于RH株弓形虫(88.0±16.9,300.0±11.3,675.0±35.4)(P<0.05)。弓形虫毒力实验结果显示,RH株弓形虫感染小鼠在第8天均存活,第14天存活率下降至30%(3/10),至第16天全部死亡;高表达ROP18 RH株弓形虫感染小鼠在第5天均存活,第8天存活率下降至30%(3/10),至第9天全部死亡。结论构建了高表达毒力因子ROP18的转基因弓形虫虫株。
- 蒋宗儒安然杨杰万俐娟都建
- 关键词：弓形虫
- 弓形虫ROP18重组腺病毒载体的构建及其对神经干细胞C17.2凋亡的影响被引量：3
- 2016年
- 目的构建弓形虫棒状体蛋白ROP18重组腺病毒载体,研究其对神经干细胞C17.2凋亡的影响。方法将弓形虫ROP18从PEGFP-G2-ROP18重组质粒上亚克隆至腺病毒载体pHBAd-MCMV-GFP,重组腺病毒载体pHBAd-MCMVGFP-ROP18经PCR、测序鉴定正确后,与骨架质粒pHBAd-BHG共转染HEK293细胞进行包装,收获、扩增重组腺病毒并对其滴度进行测定。以MOI=70的重组腺病毒感染神经干细胞C17.2,转染不同时间荧光显微镜观察基因的表达情况。转染48h用CCK-8法检测C17.2的增殖情况;转染24h采用Annexin V-APC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blot法检测半胱天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的蛋白水平。结果重组ROP18过表达腺病毒在C17.2神经干细胞内能有效表达。转染48h,与空载体对照组相比,C17.2细胞增殖活性明显降低(P<0.05);转染24h,流式细胞术检测结果显示,ROP18基因转染组C17.2细胞凋亡率明显增加(P<0.001);Western blot检测显示caspase-3活性片段的表达明显增加(P<0.05)。结论成功构建了弓形虫ROP18重组腺病毒并在神经干细胞C17.2中表达,ROP18重组腺病毒能诱导C17.2神经干细胞凋亡。
- 张贤甘小凤程正阳都建罗庆礼沈继龙余莉
- 关键词：刚地弓形虫重组腺病毒细胞凋亡
- 一种表达TgMIF蛋白的巨噬细胞在制备治疗肝纤维化药物中的应用
- 本发明公开表达TgMIF蛋白的巨噬细胞在制备治疗肝纤维化药物中的应用，涉及肝纤维化技术领域，所述TgMIF蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的有益效果在于：本发明中的TgMIF蛋白能够持续定向诱导巨噬细...
- 都建陈滢陈立建王杰周南安然蔡海建
- MANF对内质网应激诱导的细胞凋亡的保护作用被引量：5
- 2013年
- 目的构建中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)基因真核表达质粒并转染小鼠神经瘤细胞系(N2A),建立稳定表达MANF的细胞系,并观察MANF对内质网(ER)应激诱导细胞凋亡的影响。方法将MANF基因克隆至pEGFP-C2载体中,经酶切、聚合酶链式反应(PCR)、测序检测其构建的正确性,脂质体转染法将重组质粒转染入N2A细胞,经G418(500μg/ml)连续筛选,获得稳定表达MANF的神经细胞系。细胞免疫荧光法观察MANF的定位,蛋白质印迹法(Western blot)和反转录PCR法(RT-PCR)鉴定稳转细胞系中MANF的蛋白和基因表达水平。在稳定转染细胞系中,分别用4μg/ml衣霉素(TM)处理16 h和10μmol/Lβ淀粉样蛋白(Aβ)处理24 h诱导ER应激,Western blot法检测CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)的表达和Caspase-3的激活情况。结果构建的pEGFP-C2-MANF质粒经酶切测序等鉴定确定构建成功,经G418抗性筛选出稳定转染MANF的N2A细胞系,RT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光法证明稳转细胞中MANF的基因和蛋白水平均高表达,并且MANF的细胞定位准确。诱导ER应激后,MANF能显著抑制CHOP的表达和Caspase-3的激活。结论成功建立稳定表达MANF的神经细胞系,并且发现MANF可以抑制ER应激诱导的神经细胞凋亡。
- 陈滢李成锦杨文程里安然都建沈玉君冯利杰沈玉先
- 关键词：转染内质神经保护
- 浅谈医学院校生物化学与分子生物学实验室安全管理被引量：2
- 2017年
- 高校生物化学与分子生物学实验室是高校进行科学研究、实践教学的重要场所,在教学和科研中需运用大量仪器设备和试剂药品,因此,实验室的安全管理尤其重要,本文针对本校生物化学与分子生物学实验室,指出存在的安全隐患并提出对策,为实验教学的有效进行提供参考。
- 安然都建
- 关键词：生物化学与分子生物学实验室安全隐患安全管理
- 一种预防弓形虫病的ME49Δcdpk3减毒活疫苗及其制备方法和应用
- 本发明涉及弓形虫疫苗技术领域，具体来说是一种用于预防弓形虫病的ME49Δcdpk3减毒活疫苗，减毒活疫苗是通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术在ME49上敲除CDPK3构建的ME49Δcdpk3虫株，减毒活疫的制...
- 都建吴敏敏蔡海建安然陈滢周南
- 文献传递
- 一个新的与CENP-E结合的动点蛋白CENP-V的发现与功能研究
- 细胞生命过程中遗传物质的稳定性是通过有丝分裂过程中染色体在两个子细胞中的均等分配而实施的。细胞有丝分裂纺锤体微管与着丝粒的粘连是通过动点——组装在着丝粒上的一个巨大的蛋白质复合物而实现的。对于酵母和蠕虫中大量的动点外层蛋...
- 都建秦宜德姚雪彪
- 关键词：纺锤体CENP-E
- 一种预防弓形虫病的ME49Δcdpk3减毒活疫苗及其制备方法和应用
- 本发明涉及弓形虫疫苗技术领域，具体来说是一种用于预防弓形虫病的ME49Δcdpk3减毒活疫苗，减毒活疫苗是通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术在ME49上敲除CDPK3构建的ME49Δcdpk3虫株，减毒活疫的制...
- 都建吴敏敏蔡海建安然陈滢周南
