目的采用复合模式介质Capto core 700纯化轮状病毒(rotavirus,RV),去除培养液中的残余细胞宿主蛋白和DNA,提高病毒收率。方法将RV LH9毒种接种Vero细胞,制备RV原液,澄清、超滤后,用Capto core 700纯化:样品LH9、LH9+150 mmol/L Na Cl[以缓冲液A(20 mmol/L PB+150 mmol/L Na Cl,p H 7.0)作为缓冲液]上样纯化分别标记为A、B组合,样品LH9+300 mmol/L Na Cl[以缓冲液B(20mmol/L PB+300 mmol/L Na Cl,p H 7.0)作为缓冲液]上样纯化标记为C组合,样品LH9+450 mmol/L Na Cl[以缓冲液C(20 mmol/L PB+450 mmol/L Na Cl,p H 7.0)作为缓冲液]上样纯化标记为D组合,洗脱,收集流穿峰,检测纯化后病毒的滴度和收率、RV RNA、RV抗原性、残余宿主细胞蛋白(HCP)和DNA;并用初步筛选出的纯化组合纯化3批RV超滤浓缩液,检测各项指标,进行进一步验证。结果用20 mmol/L PB+150 mmol/L Na CL缓冲体系和样品中加入150 mmol/L Na Cl的组合纯化RV,病毒收率在80%以上,病毒核酸完整,其抗原性未发生改变,可去除94%以上的HCP,残余DNA符合《中国药典》三部(2010版)标准。结论 Capto core 700纯化RV收率和残余蛋白去除效率均较高,组合B操作相对简便,工艺时间短,病毒收率高,更适于RV的纯化。
目的利用Vero细胞生物反应器微载体培养技术规模化培养轮状病毒重配株LH9(G4型)。方法用3 L生物反应器,以4 g/L载体浓度培养Vero细胞,待细胞浓度达1.8×106个/ml时,分别用含2、1、0.75、0μg/ml胰酶的DMEM培养液,35℃连续培养21 d,观察细胞生长状态。分别按0.5、0.1、0.05、0.01 MOI接种轮状病毒重配株LH9(G4),培养过程中每日取样,检测病毒滴度以及葡萄糖、乳酸含量。根据培养过程中葡萄糖、乳酸含量的变化,确定病毒培养过程中的收获时间,优化培养工艺。结果在反应器中用含不同浓度胰酶的DMEM培养Vero细胞,细胞形态良好,与不含胰酶的DMEM培养液培养的细胞无明显差异;按0.05 MOI接种后的病毒收获液滴度较高,可达7.0 lg CCID50/ml,且持续时间较长;通过对病毒培养液中葡萄糖、乳酸含量的监测,调整了培养过程中的收获时间,收获次数增加至4次,可收获病毒液4个工作体积,病毒高峰滴度可达8.5 lg CCID50/ml。结论采用生物反应器微载体系统培养轮状病毒重配株LH9(G4),可显著提高病毒滴度,通过对培养过程的优化,增加了病毒收获量,为进一步规模化生产轮状病毒疫苗奠定了基础。
