李晔
- 作品数：14 被引量：21H指数：3
- 供职机构：天津商业大学生物技术与食品科学学院天津市食品生物技术重点试验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金天津市高等学校科技发展基金计划项目更多>>
- 相关领域：生物学农业科学轻工技术与工程化学工程更多>>
- 利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌sopB基因被引量：5
- 2014年
- 利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌LT2的(Salmonella enterica serovar typhimurium LT2,S.typhimurium LT2)sopB基因。以pKD4质粒为模板,扩增得到中间带有卡那霉素抗性基因且两端各带有59 bp分别与sopB基因上下游序列同源的同源打靶片段,将其转化至表达Red重组酶的S.typhimurium LT2感受态细胞中;在抗生素压力和λRed重组系统帮助下,同源片段和菌体sopB基因发生同源重组,通过卡那霉素筛选得到带有抗性标记的阳性重组菌;转入重组酶表达质粒pCP20以除去抗性标记,得到保留单一FRT位点的突变菌株;利用PCR技术鉴定重组菌,并通过检测沙门氏菌效应蛋白SopB的分泌以及沙门氏菌感染HeLa细胞后pAKT的激活反应来鉴定sopB基因是否被敲除。构建的ΔsopB突变菌株失去了分泌SopB蛋白的能力,且不能够像野生型菌株那样在感染HeLa细胞的过程中激活pAkt。本研究获得了S.typhimurium LT2的sopB基因缺失突变株,为沙门氏菌感染宿主过程中SopB的功能研究提供工具,同时也为进一步探索其他类型细菌的基因敲除提供了线索。
- 李晔张西轩郭梦征王素英张坤生阮海华
- 在大肠杆菌中表达胶原酶的DNA分子、重组胶原酶的方法及应用
- 本发明公开了一种表达胶原酶的大肠杆菌及其构建方法与应用。本发明一种蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus R75E分泌的一种胶原酶的氨基酸序列(如SEQ ID NO:1所示)与核苷酸序列(如SEQ ID NO:2所示...
- 阮海华张西轩李晔杜康龙张真
- 文献传递
- 一种从大肠杆菌包涵体中分离纯化GST-TRAF6融合蛋白的方法被引量：2
- 2014年
- 利用8 mol/L尿素溶液对表达在大肠杆菌包涵体中的GST-TRAF6融合蛋白进行变性,通过逐级稀释复性的方法对尿素溶解后的GST-TRAF6融合蛋白进行复性,将复性后的GST-TRAF6融合蛋白进一步利用谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析的方法进行分离纯化,将分离纯化后的蛋白通过Western blot方法进行验证,最后利用体外泛素化反应检测经包涵体变性、复性和纯化后的GST-TRAF6融合蛋白的生物学活性。经过包涵体变性、梯度稀释复性和谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析3个步骤后纯化得到纯度达90%以上、浓度为396 ng/μL的蛋白质溶液。利用GST蛋白作为对照,经Western blot验证表明,纯化得到的蛋白确为GSTTRAF6融合蛋白。进一步利用体外泛素化反应分析其泛素连接酶活性发现,17 ng/μL浓度的GST-TRAF6融合蛋白能够以泛素分子作为底物在5 min内快速催化自由泛素链的生成。结果表明,表达在大肠杆菌包涵体中的GST-TRAF6融合蛋白经尿素变性溶解后能够成功复性并分离纯化,在溶解性改变的同时恢复了其泛素连接酶活性。为从大肠杆菌包涵体中大规模分离纯化蛋白质提供了一种新的复性方法。
- 张西轩李晔张振奇董世瑞赵培阮海华
- 关键词：TRAF6蛋白纯化包涵体复性重组蛋白
- 蜡样芽孢杆菌胶原酶基因colR75E在毕赤酵母中的重组表达被引量：1
- 2017年
- 【目的】利用毕赤酵母真核表达系统表达蜡样芽孢杆菌胶原酶Col R75E,寻找一种安全、稳定的方式体外制备具有高活性的胶原酶。【方法】以蜡样芽孢杆菌R75E基因组DNA为模板,采用PCR法扩增胶原酶col R75E基因,构建p PICZαA/col R75E重组质粒,将该质粒线性化后电转化至毕赤酵母X-33菌株,诱导其表达并对表达条件进行优化。将表达后的酵母发酵液上清通过硫酸铵沉淀、脱盐处理及亲和层析纯化步骤获得高纯度重组Col R75E胶原酶。利用胶原酶活力测定、SDS-PAGE电泳、胶原酶谱、I型胶原蛋白及不同底物蛋白降解产物电泳等方法对重组胶原酶Col R75E的活性及底物特异性进行分析。【结果】毕赤酵母中最佳表达重组胶原酶Col R75E的条件为p H 6.0,甲醇终浓度为2.5%,诱导时间72 h,诱导后的蛋白经SDS-PAGE、胶原酶谱以及I型胶原蛋白降解产物电泳分析发现,毕赤酵母中表达的重组胶原酶分子量符合预期,蛋白纯度超过95%,具有较好的胶原蛋白水解活性并测得其比活力为4.977 U/mg。该酶对I型胶原蛋白表现出较好的专一性,但是对牛血清白蛋白、酪蛋白及溶菌酶蛋白没有水解活性。【结论】利用毕赤酵母真核表达系统能够获得高活性的蜡样芽孢杆菌胶原酶Col R75E,为该胶原酶广泛应用于医疗、食品等工业领域奠定了理论和方法基础。
- 张真李晔张西轩胡双艳阮海华
- 关键词：蜡样芽孢杆菌胶原酶毕赤酵母I型胶原蛋白
- 一种蜡样芽孢杆菌及其应用
- 本发明公开了一种蜡样芽孢杆菌及其应用，而提供一种能够同时分泌两种分子量类型的胶原酶的蜡样芽孢杆菌及其制备方法和应用。本发明的蜡样芽孢杆菌为Bacillus cereus，保藏编号为CGMCC NO.8614，所产生的酶液...
- 阮海华张西轩王素英李晔
- 文献传递
- 蜡样芽孢杆菌胶原酶的分离纯化及其在毕赤酵母中表达的研究
- 胶原酶是一种能特异性降解天然胶原纤维的酶类，微生物所产的胶原酶以底物范围广、酶切位点多、生产成本低等优点被广泛应用，如细胞培养时取出细胞外基质、用于肉制品的处理使肉品鲜嫩可口、临床治疗一些胶原沉积性疾病等。但是目前常见的...
- 李晔
- 关键词：毕赤酵母胶原蛋白同源重组
- 一种用于筛选微生物胞外胶原酶的酶谱方法
- 本发明公开了一种用于筛选微生物胞外胶原酶的酶谱方法，以利用胶原酶对胶原蛋白的特异性降解作用对胶原酶进行酶谱分析。电泳过程中所采用的凝胶为在10％SDS-PAGE凝胶中添加质量体积比浓度为0.1％的Ⅰ型胶原蛋白。凝胶的处理...
- 阮海华张西轩王素英李晔
- 文献传递
- 沙门氏菌效应蛋白SopB288～309肽段介导SopB依赖的HeLa细胞AKT的磷酸化研究
- 2014年
- [目的]研究沙门氏菌效应蛋白SopB中跨膜疏水结构域288-309肽段对受SopB诱导的HeLa细胞Akt磷酸化激活中的功能。[方法]通过重叠延伸PCR的方法构建SopB第288~309位肽段缺失突变基因,并将该基因在HeLa细胞中进行异位表达,与野生型SopB基因进行比较,确定缺失的第288~309位间肽段在受SopB诱导的Akt磷酸化激活中的作用。[结果]与空载体对照相比较,在HeLa细胞中表达野生型SopB重组质粒明显激活了pAkt473的磷酸化,而在HeLa细胞中表达SopB缺失突变体SopBΔ288-309时,则检测不到pAkt473的磷酸化激活。[结论]SopB表达激活HeLa细胞pAkt473的磷酸化与其第288~309位肽段的功能直接相关,该跨膜疏水结构域的缺失导致SopB蛋白不能亚细胞定位至细胞膜,从而导致SopBΔ288-309对pAkt473磷酸化激活功能的丧失。
- 李晔张西轩阮海华
- 关键词：沙门氏菌属
- 人泛素结合酶UbcH5c活性突变体的构建·纯化以及催化活性研究被引量：2
- 2014年
- [目的]构建人泛素结合酶UbcH5c的活性位点突变体S22R和F62A,同时分析这2种突变体蛋白与野生型蛋白在泛素化反应中的活性差异。[方法]通过点突变(Site-Directed Mutagenesis)的方法构建2种突变体质粒,利用0.5 mmol/L IPTG分别诱导2种突变体蛋白在大肠杆菌中进行表达;将菌体超声破碎后,依次利用阳离子交换层析法对UbcH5c突变蛋白进行分离纯化,最后利用体外泛素化酶促反应结合蛋白免疫印迹杂交的方法分析野生型UbcH5c与其活性突变体UbcH5c S22R和UbcH5c F62A在泛素化修饰上的差异。[结果]人泛素结合酶UbcH5c的2个突变体蛋白S22R、F62A的泛素化修饰程度明显弱于野生型蛋白。[结论]突变体S22R和F62A突变均不同程度的改变了人泛素结合酶UbcH5c与泛素分子之间的结合活性,即2个突变的位点中第62位苯丙氨酸残基及第22位丝氨酸残基均是UbcH5c结合泛素的关键位点,而且后者对于UbcH5c结合泛素活性的影响更大。
- 张西轩李晔阮海华
- 关键词：泛素化修饰点突变
- 一种蜡样芽孢杆菌及其应用
- 本发明公开了一种蜡样芽孢杆菌及其应用，而提供一种能够同时分泌两种分子量类型的胶原酶的蜡样芽孢杆菌及其制备方法和应用。本发明的蜡样芽孢杆菌为Bacillus？cereus，保藏编号为CGMCC？NO.8614，所产生的酶液...
- 阮海华张西轩王素英李晔
- 文献传递
