张真
- 作品数：7 被引量：11H指数：2
- 供职机构：天津商业大学生物技术与食品科学学院天津市食品生物技术重点试验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生轻工技术与工程化学工程更多>>
- 在大肠杆菌中表达胶原酶的DNA分子、重组胶原酶的方法及应用
- 本发明公开了一种表达胶原酶的大肠杆菌及其构建方法与应用。本发明一种蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus R75E分泌的一种胶原酶的氨基酸序列(如SEQ ID NO:1所示)与核苷酸序列(如SEQ ID NO:2所示...
- 阮海华张西轩李晔杜康龙张真
- 文献传递
- 蜡样芽孢杆菌胶原酶基因colR75E在毕赤酵母中的重组表达被引量：1
- 2017年
- 【目的】利用毕赤酵母真核表达系统表达蜡样芽孢杆菌胶原酶Col R75E,寻找一种安全、稳定的方式体外制备具有高活性的胶原酶。【方法】以蜡样芽孢杆菌R75E基因组DNA为模板,采用PCR法扩增胶原酶col R75E基因,构建p PICZαA/col R75E重组质粒,将该质粒线性化后电转化至毕赤酵母X-33菌株,诱导其表达并对表达条件进行优化。将表达后的酵母发酵液上清通过硫酸铵沉淀、脱盐处理及亲和层析纯化步骤获得高纯度重组Col R75E胶原酶。利用胶原酶活力测定、SDS-PAGE电泳、胶原酶谱、I型胶原蛋白及不同底物蛋白降解产物电泳等方法对重组胶原酶Col R75E的活性及底物特异性进行分析。【结果】毕赤酵母中最佳表达重组胶原酶Col R75E的条件为p H 6.0,甲醇终浓度为2.5%,诱导时间72 h,诱导后的蛋白经SDS-PAGE、胶原酶谱以及I型胶原蛋白降解产物电泳分析发现,毕赤酵母中表达的重组胶原酶分子量符合预期,蛋白纯度超过95%,具有较好的胶原蛋白水解活性并测得其比活力为4.977 U/mg。该酶对I型胶原蛋白表现出较好的专一性,但是对牛血清白蛋白、酪蛋白及溶菌酶蛋白没有水解活性。【结论】利用毕赤酵母真核表达系统能够获得高活性的蜡样芽孢杆菌胶原酶Col R75E,为该胶原酶广泛应用于医疗、食品等工业领域奠定了理论和方法基础。
- 张真李晔张西轩胡双艳阮海华
- 关键词：蜡样芽孢杆菌胶原酶毕赤酵母I型胶原蛋白
- 蜡样芽孢杆菌ColR75E胶原酶的表达、纯化及酶学性质研究被引量：4
- 2015年
- 目的：为了进一步了解蜡样芽孢杆菌R75E胶原酶colR75E的特性，在大肠杆菌原核表达系统中表达colR75E胶原酶，并对表达的重组胶原酶进行纯化以及酶学性质研究。方法：以蜡样芽孢杆菌R75E基因组DNA为模板采用PCR法获得胶原酶cozR75E基因，构建pET28a／colR75E重组质粒，并在大肠杆菌B121（DE3）中进行诱导表达，利用Ni—NTA纯化的方式获得高纯度ColR75E胶原酶，利用胶原酶谱、胶原酶活力测定、I型胶原蛋白降解产物电泳检测等方式对ColR75E胶原酶的酶学特性进行分析。结果：通过Ni-NTA纯化获得的蛋白经胶原酶谱、I型胶原蛋白降解产物的检测时均表现出胶原蛋白的降解能力。在标准条件下测得其比活力为3．62U／mg，Km为25．55μmol／L（2．93mg／ml），Vmax为5．71μmol／（mg·min）。ColR75E胶原酶的最适反应温度为45℃，最佳反应pH为8．0。此外，ColR75E胶原酶对于不高于50℃的温度以及pH6．0—8．0的酸碱度范围具有良好的稳定性。ColR75E胶原酶可被Ca2＋激活、但被Zn2＋、Ph2＋、Fe、Mn2＋等金属离子抑制，抑制能力依次为Pbn〉Znn〉Fe2＋〉Mn2＋。ColR75E胶原酶对EDTA和EGTA的高敏感性进一步证实了该胶原酶为一种金属蛋白酶。结论：利用大肠杆菌原核表达系统获得高纯度高活性的蜡样芽孢杆菌胶原酶是可行的，为该胶原酶广泛应用于医疗、食品等工业领域中奠定了理论基础。
- 张西轩李晔王亚航杜康龙张真阮海华
- 关键词：蜡样芽孢杆菌胶原酶I型胶原蛋白酶学性质
- 一种蜡样芽胞杆菌胶原酶的纯化方法
- 本发明公开了一种蜡样芽胞杆菌胶原酶的纯化方法。本发明用于从蜡样芽胞杆菌R75E的液体培养物中纯化胶原酶，包括粗酶液的获得和高纯度胶原酶的柱层析制备过程；粗酶液的获得：在LB肉汤固体培养基上划线复苏蜡样芽胞杆菌R75E三代...
- 阮海华李晔张西轩杜康龙张真
- 文献传递
- TRAF6介导鼠伤寒沙门氏菌感染诱导的STAT3激活的机制研究
- 鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium，S. Typhimurium）能够通过Ⅲ型分泌系统（Type III secretion systems，T3SSs）将效应...
- 张真
- 关键词：鼠伤寒沙门氏菌分子机制
- 文献传递
- 产胶原酶的蜡样芽胞杆菌发酵条件优化及酶的分离纯化被引量：6
- 2016年
- 【目的】优化蜡样芽胞杆菌R75E菌株产胶原酶的条件,并通过蛋白分离纯化技术获得高纯度胶原酶。【方法】利用单因素及正交试验优化蜡样芽胞杆菌R75E产胶原酶的发酵条件及发酵培养基,将发酵液离心除菌后得到粗酶液,对其依次通过硫酸铵分级沉淀、Butyl FF疏水层析及SuperdexTM 200凝胶过滤层析等方法对目标胶原酶进行分离纯化,利用SDS-PAGE电泳检测其纯度。【结果】优化后发酵条件为培养温度41°C、接种量6%、培养时间36 h,优化后发酵培养基为葡萄糖10 g/L、蛋白胨5 g/L、起始p H 7.0,粗酶液酶活力较优化前提高了2.9倍;将该粗酶液经过一系列纯化后得到纯度超过90%的胶原酶产物,其纯化倍数和回收率分别为18.4和1.1%。【结论】获得蜡样芽胞杆菌R75E的最佳产酶条件,并对胶原酶分离纯化的方法进行了探索,为微生物胶原酶的开发应用奠定基础。
- 李晔张西轩曹广秀张真阮海华
- 关键词：蜡样芽胞杆菌胶原酶发酵条件优化分离纯化
- 单宁酸通过抑制TRAF6向细胞质膜的招募抑制Akt信号通路被引量：1
- 2018年
- 目的:表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,也称Akt)信号通路在大多数人类实体肿瘤中过度激活、表达失调,促进肿瘤细胞增殖。植物单宁属于植物多酚类物质,能够抑制肿瘤细胞的增殖。然而,单宁酸通过何种机制调控肿瘤细胞中过度激活的Akt信号通路仍不清楚。方法:本实验选用人胶质瘤U87细胞作为模型,研究单宁酸抑制人胶质瘤U87细胞EGFR/Akt信号通路的分子机制。结果:单宁酸抑制人胶质瘤U87细胞Akt的磷酸化以及受Akt信号通路调控的相关蛋白4EBP-1和核糖体S6蛋白的磷酸化。进一步研究发现,单宁酸抑制肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis receptor-associated factor6,TRAF6)向细胞质膜的招募,导致与TRAF6相互作用的Akt蛋白减少,进而抑制人胶质瘤细胞中Akt的磷酸化激活。利用EGFR组成型激活突变体EGFR v III研究单宁酸对TRAF6向细胞质膜招募的影响发现:一方面单宁酸对EGFR的抑制作用需要EGFR胞外区第2~7外显子区域的存在;另一方面单宁酸对EGFR磷酸化的抑制是导致TRAF6向细胞质膜招募减少的原因。结论:EGFR是单宁酸发挥其抗肿瘤作用的受体蛋白,单宁酸通过抑制EGFR的磷酸化改变TRAF6向细胞质膜的招募进而介导了单宁酸对肿瘤细胞中Akt磷酸化的抑制,从而控制蛋白质的翻译,为食品来源单宁酸的抗肿瘤研究提供理论依据。
- 阮海华胡双艳张春晨曹婳张真
- 关键词：单宁酸招募
