杨晶鑫
- 作品数：4 被引量：10H指数：3
- 供职机构：北京大学生命科学学院蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 单链尿激酶型纤溶酶原激活剂Kringle结构域催化功能探讨被引量：6
- 2001年
- Kringle(K)结构域广泛存在于与凝血和纤溶相关的各种因子中 .虽然 K结构域在一级结构上是一种比较保守的结构域 (与其他结构域相比 ) ,但是 K结构域的功能在各种因子中的作用有很大的区别 .为探讨单链尿激酶型纤溶酶原激活剂 (scu- PA)的 K结构域功能 ,构建了在 scu- PA的 K结构域的 1 1 8位 Gly与 1 1 9位 Leu之间插入 PRGDWR序列的突变体 (称为 insert mutant B,In B) ,并测定了野生型 scu- PA与 In B的纤溶相关反应的动力学常数 . scu- PA与 In B水解 S- 2 4 4 4反应的 Km 值无明显变化 (分别为 60 .4与 56.8μmol·L-1) ,而 In B的 kcat值 (0 .33s-1)比 scu- PA的 kcat值 (7.31 s-1)降低很多 ;In B激活纤溶酶原反应的 Km 值 (0 .397μmol· L-1)比 scu- PA Km 值(0 .648μmol·L-1)降低 40 % ,但 kcat值 (0 .0 1 65s-1)比 scu- PA的 kcat值 (0 .0 62 6s-1)降低 74% .以上结果说明 :K结构域主要与反应活性相关 ,而与酶及底物的亲和性无关 .
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- 关键词：KRINGLE结构域
- 一种新的纤溶酶原激活反应动力学研究方法被引量：5
- 2001年
- 在溶栓研究中 ,纤溶酶原激活剂 (plasminogen activator,PA)激活纤溶酶原 (plasminogen,Plg)反应的动力学常数的测定占有重要地位 .在前人的研究中 ,虽然进行了这项实验 ,但是并未给出一个方便、快捷的测定方法 .所以建立一种更准确 ,更适合一般的实验室条件的 PA分子激活 Plg反应动力学常数的测定方法是必要的 .在对该反应进行数学分析的基础上 ,得到由可测量表示的纤溶酶 (plasmin,Plm)生成速度 (v(Plm) )的计算公式 ,由 v(Plm)及相应已知量可进一步推导出 Km、kcat的表达式 ,最终测得相应动力学常数 .用这种方法测定的由甲醇酵母 (pichia pastoris)表达的人单链尿激酶型纤溶酶原激活剂 (human single chain urokinase- PA,scu- PA)激活 Plg的反应的 Km=0 .648μmol·L-1,kcat=0 .0 62 6s-1,与文献报导相符 (Km=0 .4～ 1 .1 μmol· L-1,kcat=0 .0 2～ 0 .0 93) s-1,说明此方法是可靠的 .又因该法只需相应底物及酶标仪且为连续测定 ,所以十分简便 .
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- 关键词：纤溶酶原动力学常数纯化
- 纤维蛋白对尿激酶原激活纤溶酶原反应动力学的影响被引量：1
- 2001年
- 反应体系中存在的纤维蛋白 (fibrin)对尿激酶 (UK)、scu PA以及组织型纤溶酶原激活剂 (t PA)激活纤溶酶原 (plasminogen)的反应有不同的作用 :UK、t PA激活 plasminogen的反应可被反应体系中存在的fibrin所加强 ;fibrin对scu PA激活 plasminogen反应的动力学常数无明显影响 ;但对小分子质量scu PA与单链抗体的嵌合分子激活 plasminogen的反应起明显的抑制作用 .为确定反应体系中存在的fibrin对scu PA的K区插入突变体 InB激活plasminogen反应的影响 ,测定了在反应体系中存在fibrin的情况下的InB激活 plasminogen反应的Kfibrinm 以及kfibrincat .Kfibrinm =4 2 μmol·L-1,远远大于无fibrin时的Km=0 379μmol·L-1,说明有fibrin存在时突变体InB与天然底物 plasminogen的亲和性降低了 .kfibrincat =0 10 7s-1,也远远大于无fibrin时kcat=0 0 16 5s-1,说明有fibrin存在时突变体InB对plasminogen的反应活性增强了 .原因可能是 :与fibrin结合的 plasminogen的构象发生了有利于被纤溶酶原激活剂水解的变化 .
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- 关键词：纤维蛋白纤溶酶原动力学
- PRGDWR-尿激酶原双功能嵌合分子的性质研究被引量：3
- 2001年
- 为赋予单链尿激酶型纤溶酶原激活剂 (singlechainurokinase typeplasminogenactivator,scu PA ,尿激酶原 )以抗血小板聚集的功能 ,在scu PA的kringle区 118位Gly与 119位Leu之间插入PRGDWR序列 (insertmutantB ,InB) .利用甲醇酵母 (Pichiapastoris)进行分泌表达 ,经金属离子螯合亲和层析与S强阳离子交换层析 ,得到纯蛋白 .实验测定InB对人工合成底物S 2 44 4的酰胺解活性为 5 90 0IU/mg ,动力学常数为 :KInBm ,S 2 4 44 =5 6 8μmol·L-1,kInBcat,S 2 4 44 =0 33s-1;水解天然底物 plasminogen的动力学常数为 :KInBm ,plg=0 397μmol·L-1,kInBcat,plg=0 0 16 4s-1.InB激活 plasminogen的反应在有fibrin存在条件下InB的活性为无fibrin条件下的 46 3% .该突变体在体外激活 plasminogen的活性与同一系统表达的野生型scu PA基本相同 .该突变体表现出较强的抗血小板聚集活性 ,IC50 =12 7μmol·L-1,而野生型scu PA无此功能 .实验表明scu PA的K区插入突变体InB是一种极具潜力的双功能溶栓分子 .
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- 关键词：尿激酶原血小板聚集
