常玮
- 作品数：2 被引量：20H指数：2
- 供职机构：中国科学院昆明植物研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金湖北省自然科学基金云南省重点学科资助项目更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 油菜油体钙蛋白基因BnClo1的克隆和表达被引量：14
- 2008年
- 应用同源序列克隆法设计同源简并引物,结合RT-PCR和RACE-PCR技术,从甘蓝型油菜中分离克隆了编码28.1kD油体钙蛋白(caleosin)的基因BnClo1。其全长1058bp的BnClo1 mRNA(GenBank中序列号为AY966447)包含完整的开放阅读框和3′末端Poly(A)尾巴结构,染色体DNA结构上含6个外显子和5个内含子。Northern杂交结果表明,油菜中BnClo1在种子形成中期开始丰富表达,在种子形成后期,即种子开始脱水成熟时期,高量稳定地表达。半定量PCR结果显示,BnClo1在油菜种子吸水膨胀后前2d的茎中明显表达。证明在油菜种子发育期间,BnClo1对mRNA的转录表达是由胚胎发育来调控的,具有显著的时空特性,并与油体的形成和积累密切有关。推测的caleosin蛋白为245个氨基酸残基(GenBank中序列号为AAY40837)组成的两性蛋白质,主要含3个结构域即由N末端1～16位氨基酸残基组成的α-螺旋和17～61位氨基酸残基组成的强亲水性的随机卷曲构成的N-末端亲水性结构域;由80～120位氨基酸残基组成的中间疏水性结构域和C-末端亲水性结构域。N-末端亲水性结构域包含一个潜在的结合Ca2+的EF-手结构。中间疏水性结构域包含一个潜在的脯氨酸-结(proline-knot)模体,在92～114位氨基酸残基组成的α-螺旋跨膜区域,推测在caleosin蛋白与单层磷脂层和油体锚定结合上及增加种子油体的稳定性上起着重要的作用。
- 丁勇陈庆波徐春雷常玮甘莉
- 关键词：RACE基因克隆NORTHERN杂交
- 甘蓝型油菜BnClo1基因克隆、表达载体的构建及原核表达被引量：7
- 2010年
- 【目的】克隆甘蓝型油菜(Brassica napus)油体钙蛋白(caleosin)基因BnClo1,并进行原核表达研究。【方法】在获得甘蓝型油菜BnClo1基因全长cDNA的基础上,根据BnClo1基因编码区设计1对特异引物,以甘蓝型油菜种子总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约750bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pTYB12中,构建融合表达载体pTYB12-BnClo1,转化到Escherichia coli ER2566(DE3)中进行表达。【结果】测序结果显示,RT-PCR获得的cDNA全长768bp,包含完整的开放阅读框738bp,编码245个氨基酸残基,caleosin分子量为28.1kD。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,以20℃、4mmol·L-1IPTG诱导该基因表达效果最好,诱导产物为一个与理论值相符的83.1kD的融合蛋白intein-caleosin。【结论】克隆了油菜BnClo1基因,并在大肠杆菌中进行了优化表达。为进一步纯化和鉴定目的蛋白,及研究其功能奠定了试验基础。
- 丁勇常玮刘小烛
- 关键词：甘蓝型油菜原核表达
