李杰
- 作品数：16 被引量：30H指数：4
- 供职机构：郑州大学生物工程系更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国际科技合作与交流专项项目河南省杰出人才创新基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 杜氏盐藻叶绿体ATP合酶α亚单位基因启动子的克隆及初步功能分析
- 2011年
- 采用DraⅠ,EcoRⅤ,PvuⅡ,ScaⅠ,Sma I和StuⅠ六种内切酶消化杜氏盐藻(Dunaliella salina)叶绿体基因组DNA,与相应DNA接头连接,构建成无载体连接的盐藻叶绿体GenomeWalker DNA文库。利用长距离PCR(long distance-polymerase chain reaction,LD-PCR)技术从该文库中克隆得到ATP合酶α亚单位(atpA)基因上游序列1 347bp。启动子特征分析显示该序列具有一般启动子的保守序列特征,根据这些特征设计引物,扩增4个5′端系列缺失的启动子片段,并用绿色荧光蛋白基因作为报告基因,构建启动子5′端系列缺失重组质粒,以期鉴定不同启动子片段的驱动报告基因转录的活性。基因枪转化结果显示,启动子长度约1 000 bp的重组载体转化盐藻后,其转化株中有黄绿色的盐藻细胞出现。说明克隆的序列具有启动子活性,能驱动绿色荧光蛋白基因在杜氏盐藻中有效表达,为建立盐藻叶绿体转化系统奠定了工作基础。
- 谷辉辉冯书营潘卫东李杰薛乐勋
- 关键词：叶绿体转化
- 杜氏盐藻高纯度叶绿体DNA的提取被引量：2
- 2008年
- 目的:分离大量完整的杜氏盐藻叶绿体,提取高纯度的叶绿体DNA(cpDNA)。方法:取对数生长后期的杜氏盐藻细胞进行高压破碎,利用差速离心和蔗糖密度梯度离心得到完整的叶绿体。采用优化的SDS-蛋白酶K-酚/氯仿/异戊醇方案抽提cpDNA,并经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果:蔗糖密度梯度离心结果表明分离到了大量的叶绿体,相差显微镜及电镜观察证实所得叶绿体的完整性。紫外分光光度仪检测3个批次cpDNA的浓度蛋白酶为(2.21±0.02)mg/L,A(260 nm)/A(280 nm)为(1.772±0.012)。结论:获得了高纯度的杜氏盐藻cpDNA,为进行叶绿体的转化研究奠定了实验基础。
- 曲东京李杰潘卫东贾彦龙薛乐勋
- 关键词：杜氏盐藻叶绿体DNA提取
- 急性阑尾炎婴幼儿血白细胞计数及C-反应蛋白测定被引量：5
- 2009年
- 目的:探讨白细胞计数及C-反应蛋白(CRP)在婴幼儿急性阑尾炎诊断和治疗中的价值。方法:选择35例3岁以下急性阑尾炎患儿(单纯性9例,化脓性14例,坏疽穿孔性及阑尾周围脓肿12例;术后有并发症15例,无并发症20例),于术后第5天检测外周血白细胞计数及CRP,并分析2者与病理类型、预后之间的关系。结果:不同病理学类型急性阑尾炎患儿外周血白细胞计数及CRP水平不同(F分别为312.86,355.10,P均<0.001);有并发症的患儿外周血白细胞数及CRP高于无并发症患儿(t分别为138.09,61.84,P均<0.001)。结论:动态监测白细胞计数及CRP可用于判断婴幼儿急性阑尾炎的病情及预后。
- 张振武李杰苏红革曹振杰
- 关键词：婴幼儿急性阑尾炎白细胞计数C-反应蛋白
- 杜氏盐藻类驱动蛋白钙调素结合蛋白马达区的表达与纯化
- 2011年
- 目的:构建杜氏盐藻类驱动蛋白钙调素结合蛋白马达区(KMD)基因原核表达载体并表达纯化KMD。方法:通过软件和在线工具预测KMD的理化性质。构建KMD的原核表达载体pET28a-KMD,而后在大肠杆菌BL21(DE3)内16℃过夜诱导表达KMD,通过超声破碎菌体和高速离心,将上清液进行亲和层析,获得粗纯目的蛋白,再利用离子交换层析和凝胶过滤层析进一步纯化。SDS-PAGE检测层析各阶段蛋白样品。将纯化后的KMD均分3份分别放置在-80℃、4℃和18℃环境中,1周后SDS-PAGE检测目的蛋白是否降解。结果:KMD相对分子质量为37480,预测pI为7.99。基因中含有的稀有密码子不会明显影响其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。多步层析后可以获得2个独立的目的蛋白洗脱峰,均为KMD且纯度可满足结晶条件搜索。纯化后的KMD在4℃和18℃下放置1周后无降解。结论:获得大量高纯度、均一性良好的KMD蛋白,能够满足培养蛋白晶体所需。
- 徐朋奇李杰张红梅石科韩康李梅薛乐勋
- 关键词：杜氏盐藻纯化
- 杜氏盐藻寡糖基转移酶亚基stt3a酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活和毒性检测
- 2011年
- 目的:观察杜氏盐藻寡糖基转移酶亚基stt3a的酵母双杂交诱饵载体表达产物对酵母细胞有无毒害作用并检测其自激活作用。方法:应用PCR方法获得stt3a可溶端的基因片段,将基因片段按正确的方向插入到酵母表达质粒pGBKT7中,经限制性内酶切鉴定正确后,用PEG/LiAc法转化到酵母菌株Y187中,并通过表型筛选检测诱饵蛋白有无毒性和自激活作用。结果:成功获得了stt3a可溶端的基因片段,其表达的蛋白对酵母菌株Y187无毒害,报告基因-半乳糖苷酶活性没有被诱导。结论:酵母双杂交GAL4系统可以被用来研究杜氏盐藻中与stt3a相互作用的蛋白。
- 侯永杰李杰李庆华王建人薛乐勋
- 关键词：杜氏盐藻酵母双杂交
- Pdx-1真核表达载体构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达被引量：2
- 2010年
- 目的 构建含有胰腺-十二指肠同源盒-1(Pdx-1)的真核表达载体,并研究其在大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达情况.方法 克隆Pdx-1基因,构建含Pdx-1的真核表达载体pEGFP-Pdx-1及pcDNA3.1-Pdx-1,转染MSCs,倒置荧光显微镜及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测MSCs中Pdx-1的表达.结果 测序结果 表明克隆的Pdx-1基因序列正确,构建的含Pdx-1的真核表达载体能有效的转染MSCs,并检测到该基因mRNA的表达.结论 完成Pdx-1基因克隆,成功构建含有Pdx-1基因真核表达载体,并在转化株中检测到该基因的表达,为糖尿病的细胞替代及基因治疗提供基础.
- 辛宁赵志刚袁慧娟李杰
- 关键词：真核表达载体构建EUKARYOTICEXPRESSIONGENEEXPRESSIONGENEGENE细胞替代
- 转染杜氏盐藻14-3-3基因对食管鳞癌EC9706细胞Bcl-2和Caspase-9蛋白表达的影响
- 2010年
- 目的:探讨转染杜氏盐藻14-3-3基因对食管鳞癌EC9709细胞Bcl-2和Caspase-9蛋白表达的影响。方法:将杜氏盐藻14-3-3基因cDNA序列分别亚克隆入表达载体pEGFP-C1和pcDNA3.1(+)的HindⅢ和BamHⅠ位点,构建真核表达载体pEGFP-C1-14-3-3和pcDNA3.1(+)-14-3-3,采用脂质体方法转染EC9706细胞,同时设立空载体对照和空白对照,荧光显微镜观察pEGFP-14-3-3融合蛋白在EC9709细胞中的定位;G-418筛选稳定转染pcD-NA3.1(+)-14-3-3的细胞株,采用RT-PCR和Western blotting法检测14-3-3基因的表达;Western blotting检测3种细胞中Bcl-2和Caspase-9蛋白的表达。结果:pEGFP-14-3-3融合蛋白定位于EC9706细胞的细胞核;通过G-418筛选,最终获得稳定表达盐藻14-3-3基因的转染细胞株;与转染空载体和空白对照的EC9706细胞相比,转染pcD-NA3.1(+)-14-3-3的EC9706细胞中Bcl-2蛋白表达量明显增高[(1.60±0.20)、(0.90±0.15)和(2.40±0.10);F=69.8897,P<0.001],而Caspase-9蛋白表达量明显降低[(1.00±0.04)、(1.40±0.08)和(0.40±0.05);F=217.0667,P<0.001]。结论:杜氏盐藻14-3-3基因可能在EC9706细胞凋亡过程中发挥了抑制作用。
- 魏攀李杰王莉莉许培荣薛乐勋
- 关键词：杜氏盐藻食管鳞癌BCL-2CASPASE-9
- 杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶基因的克隆及功能分析被引量：6
- 2011年
- 目的:探讨杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHase)基因在鞭毛再生中的作用。方法:通过设计简并引物及RACE法克隆了杜氏盐藻SAHase基因全长,使用pH休克法对杜氏盐藻进行鞭毛去除及再生,通过实时荧光定量PCR研究在转录水平上SAHase基因的变化。结果:所克隆的杜氏盐藻SAHase基因cDNA全长1926bp,包含ORF1458bp、3’UTR61bp和5’UTR407bp。实时荧光定量PCR结果显示,在鞭毛再生的过程中,SAHasemRNA转录量升高,其水平在3h时达到了未处理组的3倍左右。结论:杜氏盐藻的SAHase基因与鞭毛再生有关。
- 阎赟梦李庆华李杰柴丹丹薛乐勋
- 关键词：杜氏盐藻鞭毛
- 大鼠骨髓间充质干细胞Pdx-1基因表达水平的调控及意义
- 2011年
- 目的:将含有胰腺十二指肠同源盒-1(pancreatic duodenal homeobox-1,Pdx-1)的真核表达载体转染大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),并测定转染MSCs中Pdx-1基因的拷贝数。方法:将本实验室构建的含Pdx-1的真核表达载体pcDNA3.1-Pdx-1,转染MSCs,RT-PCR检测MSCs中Pdx-1的表达,实时荧光定量PCR检测Pdx-1基因的拷贝数。结果:构建的含Pdx-1的真核表达载体能有效的转染MSCs,并检测到该基因mRNA的表达。筛选并检测2株稳定转染细胞株Pdx-1基因的拷贝数分别为3.73、1.23。结论:成功将含有Pdx-1基因真核表达载体转染MSCs。
- 刘红梅袁慧娟李杰辛宁赵志刚
- 关键词：骨髓间充质干细胞转染真核表达拷贝数
- 杜氏盐藻硝酸盐还原酶基因5′上游序列驱动bar基因的表达
- 2008年
- 目的:探讨杜氏盐藻硝酸盐还原酶(NR)基因5′上游序列(Pnr)是否可以驱动外源基因在杜氏盐藻中的表达。方法:利用改进的重叠区扩增基因拼接法(SOEing),将杜氏盐藻NR基因5′上游序列(Pnr)与除草剂抗性基因bar融合。同时将NR基因3′端序列(Tnr)与克隆载体pEGM-7zf连接,构成中间载体pEGM-7zf-Tnr。最后将融合片段Pnr-Tnr与中间载体连接,构建含Pnr-bar-Tnr表达盒的盐藻真核表达载体p7NBT。电击法转化杜氏盐藻,通过草丁膦培养筛选转化藻株后对其进行分析。结果:转化藻株总RNA的RT-PCR结果扩增出与bar基因序列完全一致的目的片段。结论:杜氏盐藻NR基因Pnr能够驱动外源基因bar的转录。
- 闫红霞李杰王莉莉冯英才曲东京薛乐勋
- 关键词：杜氏盐藻硝酸还原酶BAR基因
